miR-132通过靶向KLF7抑制鼻咽癌细胞增殖和迁移

张可，姜岚，僧东杰，朱卿文

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于解剖位置较为隐秘的鼻咽部，属于头颈部肿瘤之一，在我国南方发病率较高。临床多采用放射联合化学疗法治疗NPC，然而其早期易出现远处转移和浸润，且复发率较高［1］。肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭是发生远处转移和复发的病理基础［2］，探究NPC细胞增殖、迁移的分子机制，寻找相关治疗靶点可能有益于其治疗效果的提高。微小RNA（miRNA）是高度保守的短链（20～25个核苷酸）非编码RNA分子，可以调控基因表达。研究显示，miRNA表达失调及功能障碍可调节肿瘤细胞增殖及转移，在NPC等肿瘤中发挥癌基因或肿瘤抑制基因的作用［3］。本研究旨在通过探讨miR-132和Kruppel样因子（KLF）7在NPC增殖、迁移和侵袭中的作用，以期为NPC的治疗提供新靶标。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级7周龄NIH-Foxn1rnu裸大鼠（均为雄性）70只，购自北京维通利华公司［许可证号：SCXK（京）2016-0006］，体质量200～220 g，于郑州大学实验动物中心［动物许可证号：SYXK（豫）2018-0004］进行本项研究，且实验过程遵守3R原则。鼻咽癌组织及正常鼻咽上皮组织均来自郑州儿童医院病理科。CNE-2Z鼻咽癌细胞和NP69永生化正常鼻咽上皮细胞均购自中国医学科学院细胞资源中心。RNA TriPure、反转录试剂及荧光定量PCR（qPCR）试剂购自Roche公司，LipofectamineTM3000转染试剂购自Invitrogen公司；miR-132 mimics及阴性对照、KLF7-WT质粒（携带KLF7 3'UTR原始序列）、KLF7-MUT质粒（携带KLF7 3'UTR突变序列）、KLF7-OE质粒及空质粒均购自上海吉玛公司；双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；引物、二辛可宁酸二钠（BCA）、HE及CCK-8试剂盒购自上海生工公司；β-actin兔多克隆抗体、KLF7兔多克隆抗体、CD34兔多克隆抗体及山羊抗兔IgG（HRP）购自Abcam公司；培养基购自HyClone公司；qPCR仪器购自Thermo公司；显微镜购自Olympus公司；电泳仪、酶标仪购自BioRad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 CNE-2Z鼻咽癌细胞采用RPMI 1640培养基（含10%FBS、1%链霉素和青霉素）进行培养，NP69永生化正常鼻咽上皮细胞采用Keratinocyte-SFM培养基（含10%FBS）进行培养，每日早晚观察细胞情况，2～3 d传代1次，取第3代状态良好的细胞进行实验。CNE-2Z细胞分组：空白组（不转染）、NC组（转染miR-132 NC和空质粒）、miR-132 mimics组（转染miR-132 mimics）、KLF7-OE组（转染KLF7-OE质粒）和miR-132 mimics+KLF7-OE组（转染miR-132 mimics和KLF7-OE质粒）。根据转染试剂盒操作说明，采用无血清培养基制备LipofectamineTM3000脂质体和miR-132 mimics或（和）KLF7-OE质粒混悬液，分别加入到相应组细胞中，混匀后置于培养箱培养24 h。

1.2.2 qPCR检测miR-132表达 Trizol法提取鼻咽癌、正常鼻咽组织和细胞中的RNA，测定浓度后用试剂盒进行反转录。以反转录所得cDNA为模板根据试剂盒说明配置qPCR反应体系，检测miR-132表达。扩增条件：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，65℃退火35 s，68℃延伸45 s，设置40个循环。以U6为内参根据公式2-ΔΔCt计算组织及细胞中miR-132相对表达量。miR-132上游引物5'-ACCGTGGCTTTCGATTG-3'，下游引物5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'，产物大小143 bp；U6上游引物5'-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3'，下游引物5'-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3'，产物大小127 bp。

1.2.3 Western blot检测KLF7蛋白表达 制备鼻咽癌及正常鼻咽组织的PBS匀浆液，收集各组细胞并经PBS漂洗3次，加入蛋白裂解液混匀，冰上裂解15 min，离心分离上清液，BCA法测定所提取的蛋白浓度。分别取20μg按顺序进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转印至PVDF膜，奶粉封闭，兔源一抗KLF7抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶500）4℃过夜孵育，洗膜后加入山羊抗兔IgG（HRP）二抗（1∶3 000）室温孵育50 min，加入ECL发光液曝光拍照，根据目的蛋白和内参β-actin条带的灰度值计算组织及细胞中KLF7蛋白相对表达量。

1.2.4 网站预测及双荧光素酶检测KLF7与miR-132的靶向关系 经TargetScan网站预测显示，KLF7 mRNA 3'UTR区存在与miR-132序列配对结合的连续位点，进一步用双荧光素酶检测验证KLF7与miR-132的靶向关系。CNE-2Z细胞分为KLF7-3'UTR-WT+miR-132 NC组、KLF7-3'UTR-WT+miR-132 mimics组、KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 NC组和KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 mimics组，用LipofectamineTM3000试剂盒分别将KLF7-WT质粒、KLF7-MUT质粒和miR-132 NC、miR-132 mimics转染相应细胞，48 h后收集细胞裂解后采用荧光素酶试剂盒进行检测。以海肾荧光素酶为对照，根据萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性×100%计算报告基因的荧光素酶活性。

1.2.5 CCK-8实验检测细胞增殖能力 收集各组细胞重新接种于96孔板（每孔100μL含1×104个细胞），培养12、24、36、48、60 h后，将10μL CCK-8溶液加入各孔，继续培养4 h，轻轻混匀后上酶标仪测量各孔在450 nm处的光密度（OD）值，绘制细胞生长曲线。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力 收集各组细胞接种于Transwell小室上层（每孔200μL含5×104个细胞），下层加入500μL RPMI培养基，置于培养箱中24 h后取出小室上层，棉签拭去上层凝胶和（或）细胞，浸没在70%乙醇中固定15 min，PBS洗涤3次后苏木精染色，封片并观察。每个小室随机读取5个视野计算通过小室上层的平均细胞数，以评估CNE-2Z细胞迁移、侵袭能力。侵袭实验前，将100μL基质胶加在上层小室中，室温过夜凝固，迁移实验则不作此处理。

1.2.7 裸鼠成瘤实验检测肿瘤体内生长情况 将雄性裸大鼠按照体质量标号后采用随机数字表法分为空白组（CNE-2Z）、NC组、miR-132 mimics组、KLF7-OE组和miR-132 mimics+KLF7-OE组，每组至少12只。取1.2.1中各组CNE-2Z细胞，用胰蛋白酶分离并计数。各组裸大鼠均经腋窝外侧皮下注射相应0.2 mL细胞悬液（1.0×107细胞/mL）。每2天用游标卡尺测量一次裸大鼠腋窝处肿瘤的最小直径（a）和最大直径（b），根据公式1/2（a2×b）计算瘤体体积。

1.2.8 免疫组化检测肿瘤血管密度 取各组裸大鼠的肿瘤组织制备石蜡切片，按顺序进行脱蜡、水化、灭活内源性过氧化物酶、抗原修复、一抗（CD34抗体）孵育、二抗孵育、链霉亲和素-过氧化物酶孵育后，加入DAB显色，苏木素染液复染后脱水、透明、封片，显微镜下拍照观察。每片任取6个视野，通过Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。判断标准：CD34阳性表示内皮细胞，由内皮细胞围绕成的不规则管腔结构判断为微血管。每张切片取6个视野进行微血管计数，以平均值代表肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.3 统计学方法 采用GraphPad 8.0对数据进行统计分析，数据以±s表示，2组间比较采用t检验，多组比较间比较采用one-way ANOVA，组间多重比较采用Bonferroni校正t检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-132在鼻咽癌组织及细胞中的表达 鼻咽癌组织中miR-132表达水平（0.35±0.05）较正常鼻咽组织（1.00±0.02）降低（n=30，t=66.111，P＜0.01）；鼻咽癌CNE-2Z细胞中miR-132表达水平（0.41±0.02）较正常鼻咽上皮细胞NP69（1.00±0.03）降低（n=6，t=40.083，P＜0.01）。

2.2 KLF7与miR-132靶向关系验证及KLF7在鼻咽癌组织及细胞中的表达 经TargetScan预测显示，KLF7为miR-132的靶基因，见图1。双荧光素酶检测结果显示，KLF7-3'UTR-WT+miR-132 NC组、KLF7-3'UTR-WT+miR-132 mimics组、KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 NC组和KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 mimics组荧光素酶活性分别为1.00±0.03、0.45±0.03、1.02±0.05和1.01±0.02，差异有统计学意义（n=6，F=400.681，P＜0.01）。与KLF7-3'UTRWT+miR-132 NC组比较，KLF7-3'UTR-WT+miR-132 mimics组荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），KLF7-3'UTR-MUT+miR-132 NC组和KLF7-3'UTRMUT+miR-132 mimics组无明显变化。Western blot结果显示，鼻咽癌组织中KLF7蛋白表达水平（3.41±0.09）较正常鼻咽组织（1.00±0.03）增高（n=30，t=139.141，P＜0.01）；鼻咽癌CNE-2Z细胞中KLF7蛋白表达水平（3.37±0.06）较正常鼻咽上皮细胞NP69（1.00±0.02）增高（n=6，t=91.790，P＜0.01），见图2。

Fig.1 The targeting relationship between KLF7 and miR-132图1 KLF7与miR-132的靶向关系分析

Fig.2 The expression levels of KLF7 in nasopharyngeal carcinoma tissues and cells图2 KLF7在鼻咽癌组织及细胞中的表达

2.3 转染miR-132 mimics和（或）KLF7-OE质粒对KLF7表达的影响 空白组、NC组、miR-132 mimics组、KLF7-OE组和miR-132 mimics+KLF7-OE组KLF7蛋白表达水平分别为1.05±0.03、1.04±0.04、0.49±0.02、2.38±0.07和1.11±0.05，差异有统计学意义（n=6，F=1 421.155，P＜0.01）。与空白组和NC组比较，miR-132 mimics组CNE-2Z细胞中KLF7蛋白表达水平显著降低，KLF7-OE组其表达水平显著增高（P＜0.05）。与miR-132 mimics组比较，miR-132 mimics+KLF7-OE组KLF7蛋白表达显著增高（P＜0.05）。

2.4 miR-132靶向KLF7对鼻咽癌细胞增殖的影响 CKK-8分析结果显示，相比空白组和NC组，miR-132 mimics组的CNE-2Z细胞36、48、60 h增殖活力显著降低，KLF7-OE组则显著增高（P＜0.05）。相比miR-132 mimics组，miR-132 mimics+KLF7-OE组的CNE-2Z细胞36、48、60 h增殖活力显著增高（P＜0.05），见表1。

2.5 miR-132靶向KLF7对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响 Transwell实验结果显示，相比空白组和NC组，miR-132 mimics组的CNE-2Z细胞迁移和侵袭数量显著降低（P＜0.05），KLF7-OE组迁移和侵袭数量均显著增高（P＜0.05）。相比miR-132 mimics组，miR-132 mimics+KLF7-OE组的CNE-2Z细胞迁移和侵袭数量显著增高（P＜0.05）。见图3、表2。

Tab.1 Comparison of CNE-2Z cell proliferation ability between the five groups at different time points表1 各组CNE-2Z细胞不同时点增殖能力比较 （n=6，OD值，±s）

Tab.1 Comparison of CNE-2Z cell proliferation ability between the five groups at different time points表1 各组CNE-2Z细胞不同时点增殖能力比较 （n=6，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与NC组比较，c与miR-132 mimics组比较，d与KLF7-OE组比较，P＜0.05

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Fig.3 Comparison of CNE-2Z cell migration and invasion between the five groups(hematoxylin dyeing,×200)图3 各组CNE-2Z细胞迁移及侵袭情况比较（苏木精染色，×200）

Tab.2 Comparison of CNE-2Z cell migration and invasion between the five groups表2 各组CNE-2Z细胞迁移及侵袭情况比较（n=6，个/视野，±s）

Tab.2 Comparison of CNE-2Z cell migration and invasion between the five groups表2 各组CNE-2Z细胞迁移及侵袭情况比较（n=6，个/视野，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与NC组比较，c与miR-132 mimics组比较，d与KLF7-OE组比较，P＜0.05

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2.6 miR-132靶向KLF7对裸鼠体内肿瘤生长的影响 相比空白组和NC组，miR-132 mimics组的肿瘤体积在第8～20天均显著降低（P＜0.05），KLF7-OE组的肿瘤体积在第8～20天均显著增高（P＜0.05）。相比miR-132 mimics组，miR-132 mimics+KLF7-OE组的肿瘤体积在第8～20天显著增高（P＜0.05）。见表3。

2.7 miR-132靶向KLF7对裸鼠肿瘤内血管生成的影响 免疫组化检测结果显示，空白组、NC组、miR-132 mimics组、KLF7-OE组和miR-132 mimics+KLF7-OE组MVD（条/视野）分别为65.47±5.06、62.86±4.93、35.14±4.51、184.83±8.50和68.07±4.28，差异有统计学意义（n=12，F=1 268.092，P＜0.01）。相比空白组和NC组，miR-132 mimics组的肿瘤内血管减少，MVD降低（P＜0.05），KLF7-OE组的肿瘤内血管增多，MVD显著增高（P＜0.05）；相比miR-132 mimics组，miR-132 mimics+KLF7-OE组的肿瘤内血管增多，MVD显著增高（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

随着放射和化学疗法的进步，放疗的敏感性和局部控制效果明显改善，然而仍有30%～40%的NPC患者会在4年内发生远处转移，严重影响预后［4］。进一步认识NPC转移的分子模式，对于开发有效的新治疗策略至关重要。目前，已在NPC中观察到多种miRNA表达失调，且特定miRNA异常表达与NPC细胞的增殖、转移和侵袭有关［5］。

miR-132在肿瘤中的作用具有差异性，其在胆管癌、胰腺癌中高表达，发挥促增殖、促侵袭等致癌作用［6-7］。然而，miR-132在更多肿瘤中表达降低，发挥肿瘤抑制作用，其中miR-132在前列腺癌中低表达，且在转移性淋巴结中的表达更低，miR-132的功能丧失可能通过提高葡萄糖代谢，促进癌细胞生长［8］。在卵巢癌和非小细胞肺癌中miR-132亦低表达，过表达miR-132可抑制细胞的增殖、克隆形成、上皮间质转化、迁移和侵袭等过程［9-10］。Chen等［11］研究显示，miR-132在甲状腺癌组织和细胞系中显著下调，过表达miR-132可通过靶向FOXA1等发挥抑癌作用。另有研究显示，miR-132在胃癌中通过靶向黏蛋白（MUC13）、CD44、纤连蛋白1（FN1）等促进胃癌细胞的扩散和远处转移［12-13］。Yang等［14］采用GSE36682芯片分析发现miR-132在NPC肿瘤组织中表达降低，且miR-132低表达与远处转移和不良预后有关。本研究也在NPC组织和细胞系中观察到miR-132表达下调，过表达miR-132可抑制CNE-2Z细胞增殖、迁移和侵袭，进一步体内实验表明过表达miR-132可抑制NPC细胞在裸鼠内生长和肿瘤内血管形成，表明在鼻咽癌中miR-132亦发挥抑癌作用，其机制有待探索。

Tab.3 Comparison of tumor volume in nude mice between the five groups at different time points表3 各组裸鼠体内不同时点肿瘤体积的比较 （n=12，mm3，±s）

Tab.3 Comparison of tumor volume in nude mice between the five groups at different time points表3 各组裸鼠体内不同时点肿瘤体积的比较 （n=12，mm3，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与NC组比较，c与miR-132 mimics组比较，d与KLF7-OE组比较，P＜0.05

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Fig.4 Comparison of angiogenesis in tumor of nude mice between the five groups(SP immunohistochemistry,×200)图4 各组裸鼠肿瘤内血管生成的比较（SP免疫组化，×200）

本研究结果显示，过表达miR-132可显著降低CNE-2Z细胞中KLF7蛋白表达，进一步通过TargetScan网站预测［15］和双荧光素酶检测证实KLF7为miR-132的直接靶标之一，推测KLF7可能是miR-132的作用靶点。KLF可与DNA转录区域结合并充当转录激活因子或阻遏因子，可影响细胞增殖、分化和迁移等过程［16］。近年研究发现，KLF7在宫颈癌［17］、肺癌［18］等多种肿瘤组织或细胞中高表达，可促进肿瘤进展，造成患者不良预后。Li等［19］报道，KLF7可调节非小细胞肺癌组织中Wnt/β-catenin信号介导的上皮间质转化过程，并作为miR-103的直接靶标，KLF7表达上调可能促进胃癌发展。另有研究发现，KLF7在神经胶质瘤中高度表达，可通过激活精氨酸琥珀酸裂合酶（ASL）转录，触发神经胶质瘤细胞的异常生长，上述作用受到miR-136-3p的负调控［20-21］。Gupta等［22］报道，KLF7可通过维持高尔基体结构和功能复杂性，促进胰腺导管腺癌生长和转移。本研究证实，KLF7蛋白在NPC组织和细胞系中均表达上调，过表达KLF7可促进CNE-2Z细胞增殖、迁移、侵袭及其在裸鼠内生长和肿瘤内血管形成，且过表达KLF7可减弱miR-132 mimics的抑肿瘤作用，进一步表明miR-132可靶向KLF7，对NPC细胞增殖、迁移及侵袭产生影响。

综上所述，miR-132在NPC组织和细胞中呈低表达，KLF7呈高表达，miR-132可通过负调控KLF7，影响NPC细胞的增殖、迁移及侵袭，这为NPC靶向治疗提供了新思路。然而miR-132具有多个靶点，且基因表达可受到多种miRNA调控。本研究仅揭示了miR-132和KLF7在NPC中的作用，因此后续还需要对miR-132的其他靶标及调控KLF7的其他miRNA进行系统分析。