重金属溶液中微藻物质光谱变化的研究

熊 鑫，王雨田，邵咏妮

（上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093）

引 言

随着城市的发展和工业产值的提高，水体中重金属镉（Cd）、铅（Pb）、镍（Ni）、铜（Cu）等[1]的含量不断增加，对动植物以及人类健康造成越来越严重的威胁。人体如长期接触镍（Ni）会使皮肤溃烂，甚至头发发白[2]。重金属危害的持久性、不易降解以及随着食物链的富集危害性逐渐增强的特点[3]，使得我们不得不重视水体重金属污染的问题。

目前，水体重金属的检测方法主要有原子吸收分光光度计法、电感耦合等离子体原子发射光谱法等。这些方法存在预处理较耗时、成本高，且不能反映水环境中生物的受污染程度等问题。为了在监测水体的同时能够了解水体生物受污染程度等，采用水体生物监测水环境情况已成为一个新的研究方向。

微藻作为水环境中重要的光合生物[4]，其再生性强、培养成本低并且无污染，由于具有快速吸附重金属的能力，可以大量投放于污水中，因此是水体污染检测的理想研究对象。Subramaniyam等利用螺旋藻有效吸附了废水中的Pb2+[5]。

随着光子学技术和材料科学技术的发展，太赫兹辐射技术的应用研究也迅速扩展到了越来越多的领域。太赫兹（THz）波位于远红外线和微波之间，频率范围为0.1～10 THz，既有红外波特性，也具有微波特性。由于太赫兹辐射的光子能量较低，不会对物质产生破坏作用，因此可对待测样品进行无损检测。另外，相比于其他的光谱技术，太赫兹波能够穿透大多数非极性材料，适合对生物组织进行活体检查。很多生物样本如脂质、蛋白质等的分子振动范围在太赫兹范围内，它们的太赫兹特征峰明显[6]。在利用太赫兹技术检测生物成分方面，Nakajima等采用太赫兹光谱（3.0～13.5 THz）对绿豆植株发芽后1～7 d内淀粉含量进行了测定，结果表明太赫兹谱可以对幼苗的不同糖类结构进行定性识别[7]。

由于斜生栅藻（亦称为微藻）的主要成分是色素和淀粉，因此微藻对重金属Pb2+吸附后，其体内色素和淀粉会发生改变。因此，本文采用斜生栅藻研究了其在不同重金属质量浓度（Pb2+:0 mg/L、0.005 mg/L、 0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L）的水体中物质成分的改变情况。实验采用太赫兹、远红外光谱技术获取不同质量浓度重金属溶液中藻体的光谱信号，通过偏最小二乘法（PLS），辨别不同重金属质量浓度下微藻样本的差异性。

1 材料与方法

1.1 生物及化学材料来源

实验所用的斜生栅藻（scenedesmus obliquus,株系276）购于中国科学院野生生物种质库的淡水藻种库。实验所用化学试剂硝酸铅（99%，分子量331.21）购于阿拉丁试剂网。

1.2 样品制备

购买的斜生栅藻需经大约2个月的培养，待其生长并达到稳定。取5份等量斜生栅藻藻液，先对其进行离心，然后弃上清液，再加入等量超纯水重复离心3次，并分别弃上清液，最终获得去除杂质的藻泥。

根据实验要求，配置5份等量的高温高压灭菌的BG11培养液，并分别装于25 mL容量瓶中。将第一份藻泥置于第一个瓶子中作为对照组（标为CK），其余4份分别配置成Pb2+的质量浓度 为0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L的重金属溶液作为实验组，并在这4份中分别加入藻泥，同时分别贴好标签A、B、C、D。将制备好的微藻样品液置于超净培养平台上，培养条件与原培养条件一致。在每次实验前，用细胞计数法测定微藻细胞为 3 ×106个/ m L ，以保证微藻在整个实验过程中处于稳定的生长状态。

1.3 傅里叶变换红外太赫兹光谱采集

室温下，在制备好10 min后的对照组和实验组A、B、C、D中分别取等量藻液于离心管中，以8 000 r/min的速度离心5 min，得到约200 mg的藻泥，加入超纯水重复离心3次并弃上清液，得到去除杂质的藻泥。然后，在每个装有藻泥的离心管中添加超纯水至1.5 mL处，将浓缩至1.5 mL的藻类溶液添加到20 mm × 20 mm的光滑聚苯乙烯模具中，并在25 ℃下干燥3 h，此时，将5组样品分别制成厚度为20 μm的薄膜。实验在真空腔内以4 c m-1的分辨率采集样本的吸收谱。每次测量结果是64次样品扫描和64次背景扫描的平均值，测量频段范围为1～20 THz。实验有5种样品，每种样品准备3个平行样本，每个平行样本上面取两个点，每个点处采集2个数据，所以每种样品共计得到12个谱线数据，而后每个谱线由12个数据取平均得到。

2 结果与讨论

2.1 藻体主要成分的光谱特征峰分析

现有研究表明[8-12]，纯品蛋白质、淀粉和类胡萝卜素在太赫兹及远红外波段有各自的特征峰位。斜生栅藻的主要成分为蛋白质、色素、淀粉等，它们具有不同的吸收谱且分布在不同的频段。Zuo等研究发现，在10～20 THz频带范围内，类胡萝卜素有多个吸收峰，分别位于12.0 THz、14.0 THz、15.5 THz以及20.0 THz左右。在室温下，类胡萝卜素又有一些中等强度的太赫兹峰，如17.5 THz处[8]；另外蛋白质特征峰为3.5～5.0 THz的包络[9]；2.3 THz、9.2～9.8 THz处为脂质的特征峰[9-11]；淀粉特征峰为9.1 THz、10.5 THz、17.3 THz处[12]。根据这些结果，我们可以通过分析水体微藻成分的光谱变化，对水体重金属质量浓度进行研判。

2.2 Pb2+溶液中藻体傅里叶变换红外太赫兹光谱变化

在确定微藻主要成分的特征吸收峰后，我们对本研究中在不同Pb2+溶液中吸附Pb2+后的斜生栅藻样本进行太赫兹光谱采集及谱峰分析，得到其主要成分的变化情况。取污染水体Pb2+的质量浓度分别为0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L，用斜生栅藻对这些水体进行吸附，得到斜生栅藻吸附10 min后的各组太赫兹光谱，如图1所示。

图1 微藻太赫兹光谱Fig.1 Terahertz spectrum of microalgae

图1（a）是斜生栅藻吸附重金属Pb2+后获得的太赫兹光谱图。图1（b）为图1（a）的基线校正图。其中，3.70 THz处形成一个大包络，9.24 THz、10.57 THz处均有明显的特征峰，这3处特征峰分别对应藻体内蛋白质、脂质、淀粉，同时13.75 THz、16.10 THz、19.88 THz对应为类胡萝卜素。

为了便于分析，我们选取微藻中蛋白质及类胡萝卜素特征峰提取出来，这些峰位吸光度随时间的变化规律如图2所示。由图2（a）、（b）可知，微藻在Pb2+溶液中吸附重金属期间，随着Pb2+质量浓度的增加，藻体内类胡萝卜素（依次对应13.75 THz、16.10 THz、17.28 THz、19.88 THz）和蛋白质（3.70 THz）光谱强度呈现递减趋势。

图2 物质成分变化Fig.2 Changes of substance composition

当Pb2+质量浓度由0 mg/L增加至0.010 mg/L时，类胡萝卜素下降幅度较大，依次达到2.53%、2.48%、2.63%、2.78%，蛋白质下降幅度达到2.79%。当Pb2+质量浓度由0.010 mg/L增加至0.050 mg/L时，类胡萝卜素和蛋白质的光谱强度下降幅度趋于平缓，如图3及表1所示。

表1 不同Pb2+质量浓度下斜生栅藻物质成分含量下降占比Tab.1 Percentage of material composition decrease in scenedesmus obliquus at different Pb2+ concentrations

图3 不同Pb2+质量浓度下斜生栅藻物质成分下降占比Fig.3 Proportion of decline in the composition of scenedesmus obliquus at different concentrations of Pb2+

2.3 基于偏最小二乘（PLS）的不同质量浓度下的藻体样本差异性辨别

由上述结果可知，微藻在吸附重金属过程中其蛋白质及类胡萝卜素的含量随之发生了改变，其中类胡萝卜素含量变化最为明显。进一步地，对于每种吸附重金属水体10 min的斜生栅藻样本，我们将其在1～20 THz范围内的吸光度值按照校正集与预测集2∶1的比例构建PLS模型矩阵。通过比较校正集和预测集的相关系数和均方根误差来判定预测模型的精度。其中校正集和预测集的相关系数分别达到0.931 09、0.971 97，均方根误差分别为0.040 41及0.037 60，结果显示10 min内不同重金属质量浓度下的微藻存在差异。

3 结 论

本文利用太赫兹、远红外光谱技术得到Pb2+溶液培养下斜生栅藻体主要成分如类胡萝卜素、蛋白质的光谱变化。通过对比斜生栅藻主要成分对应特征峰处的吸光度值，研究类胡萝卜素、蛋白质受Pb2+的响应。实验结果显示，微藻进行重金属吸附后，随着重金属质量浓度的增加，斜生栅藻内类胡萝卜素和蛋白质含量呈现下降趋势。同时，PLS结果显示，微藻吸附重金属10 min后即可以对不同质量浓度的Pb2+溶液进行区别。

实验结果表明，利用太赫兹、远红外光谱技术可以实现重金属（Pb2+）的质量浓度区别，为水体受重金属污染的实时监测提供了一种新的方法。