达那唑抑制SKM-1细胞活性并促使细胞凋亡

张永晓，刘珊，陈园园，王冬梅

（衡水市哈励逊国际和平医院血液内科，衡水053000）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是由于骨髓造血干细胞和造血祖细胞异常引起的克隆性造血干细胞疾病，其特征是血细胞减少，血液量不足以及造血功能衰竭[1]。近30%的MDS患者将最终发展到急性髓系白血病[2]。化疗和干细胞移植是临床MDS治疗的主要策略，然而由于化疗耐药、干细胞移植高成本和高风险等原因，MDS临床治疗效果有限[3,4]。因此迫切需要寻找高效且治疗成本较低的MDS药物。达那唑是人工合成的雄激素17a-乙炔睾丸酮的衍生物，具有轻度雄激素样作用，临床上达那唑主要用于治疗子宫内膜异位症和乳腺发育不良[5,6]。血液学研究[7]发现，达那唑具有类糖皮质激素的免疫抑制作用，可用于治疗免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血。有研究[8]曾报道了达那唑在骨髓增生性肿瘤和MDS等血液肿瘤性增生中的作用，然而其具体机制并不清楚[8]。

本研究中，我们主要通过MTT法研究了达那唑对MDS细胞SKM-1细胞活力的影响，并通过流式细胞实验研究了达那唑对SKM-1细胞凋亡和细胞周期的影响，最后通过蛋白免疫印迹实验研究了达那唑处理后肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）信号通路中细胞凋亡相关蛋白的表达情况。

材料和方法

1 细胞株和主要试剂

MDS细胞系SKM-1细胞购自ATCC（American type culture collection）；达那唑购自上海研生实业有限公司；胎牛血清和DMEM培养基购自美国Hyclone；DR5、caspase-8、Cleaved caspase-8、Cleaved PARP1、PARP1小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz；TUNEL染色试剂盒（一步法，绿色荧光）、GAPDH小鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自上海碧云天生物科技有限公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen；MTT试剂购自美国Sigma。

2 细胞培养

SKM-1细胞培养在添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，培养环境为37℃、5%CO2。

3 细胞活力检测

取对数期SKM-1细胞接种于96孔板，分别加入0、10、20和40μmol/L达那唑，培养24、48或72h后，加入MTT溶液，室温孵育4 h后，加入DMSO。待结晶完全溶解后，用酶标仪读取各孔在450nm波长处的光密度（OD）值，代表细胞活力。

4 流式细胞周期检测

取对数期SKM-1细胞接种于6孔板中，37℃孵育48h，培养基含0、10、20和40μmol/L达那唑。48 h后收集细胞并用70%冷乙醇在4℃条件下固定24h。随后在含有100mmol/L RNase A和400mmol/L PI的PBS缓冲液中悬浮细胞，通过流式细胞仪分析细胞周期，FlowJo软件统计。

5 TUNEL染色

SKM-1细胞接种于6孔板中，用0、10、20和40μmol/L达那唑处理SKM-1细胞48h后，PBS漂洗1次，晾干。用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS漂洗2次，用0.5% Triton X-100透化细胞5min，PBS漂洗2次。按试剂盒说明书方法配制TUNEL检测液，每孔加入100μl TUNEL检测液，37℃避光孵育45min；用DAPI染核5min，PBS洗2次，每次洗3min，抗荧光淬灭封片液封片。荧光显微镜下观察，并对TUNEL阳性细胞计数。TUNEL阳性细胞比例=TUNEL阳性细胞数/DAPI染核数×100%。

6 细胞凋亡流式细胞术检测

用0、10、20和40μmol/L达那唑处理SKM-1细胞48h后，PBS洗3次后重悬于Annexin V结合缓冲液。加入Annexin V-FITC避光孵育15min。孵育结束立即加入PI染色10min，随后在LSRII流式细胞仪中分析，FlowJo软件统计流式细胞数据。

7 蛋白质免疫印迹

细胞以RIPA裂解后，BCA法统一定量。SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，随后将蛋白质转移至甲醇预活化的PVDF膜。转移结束加入5%脱脂牛奶室温下封闭1h，室温孵育一抗（anti-GAPDH 1:5000，anti-cleaved caspase-8 1:500、anti-caspase-8 1:3000, anti-DR5 1:1000, anti-cleaved PARP1 1:1000,anti-PARP1 1:2000）2h后4 °C过夜。第2d TBST洗膜后室温孵育HRP标记的抗羊或抗鼠二抗1h，ECL化学发光显影。胶片扫描后，Quantity One软件分析条带光密度（OD）值，目的蛋白相对水平=目的蛋白的OD值/GAPDH的OD值×100%。

8 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准误表示，多组数据的均数之间两两比较采用单因素方差分析后Bonfferoni检验，P＜0.05认为有统计学意义。

结 果

1 达那唑抑制SKM-1细胞活力

MTT实验结果显示，与0μmol/L组比较，用达那唑分别处理24、48或72h后，SKM-1细胞活力均降低，达那唑浓度越高，细胞活力越低（图1）。

图1 达那唑对SKM-1细胞活性的影响。与0μmol/L组比较：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=3Fig.1 Effect of danazol on the cell viability of SKM-1 cells.*0.01＜P＜0.05,**0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=3

2 达那唑阻滞SKM-1细胞的细胞周期

细胞周期分析实验结果（图2）显示，随着达那唑浓度逐渐升高，SKM-1细胞处在S期的细胞比率逐渐降低，G0/G1和G2/M期的细胞比率均逐渐升高，细胞周期阻滞于G0/G1和G2/M期，表明达那唑浓度依赖性抑制SKM-1细胞的细胞周期。

3 达那唑促进SKM-1细胞凋亡

TUNEL染色显示，随着达那唑浓度逐渐升高，SKM-1细胞的TUNEL阳性细胞比例也逐渐升高（图3）。Annexin V-FITC/PI法流式细胞术分析显示，随着达那唑浓度逐渐升高，SKM-1细胞的凋亡比例逐渐升高（图4）。以上结果说明，达那唑浓度依赖性促进SKM-1细胞的凋亡。

图2 . 达那唑对SKM-1细胞的细胞周期的影响。A，细胞周期的代表性流式细胞术分析结果；B，各细胞周期中细胞百分比的统计分析；与0μmol/L 组比较：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=4Fig. 2 Effect of danazol on the cell cycle of SKM-1 cells. A, representative flow cytometry analysis results of cell cycle; B, statistical analysis of the percentage of cells in each cell cycle; *0.01＜P ＜0.05,**0.001＜P ＜0.01, ***P ＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=4

4 达那唑上调 DR5、cleaved PARP1和 cleaved caspase-8水平

Western blot检测显示，随着达那唑浓度逐渐升高，SKM-1细胞中DR5水平、cleaved PARP1/PARP1和cleaved caspase-8/caspase-8比率也逐渐增加（图5），说明达那唑浓度依赖性上调SKM-1细胞中DR5、cleaved PARP1和cleaved caspase-8水平。

讨 论

MDS是骨髓造血干细胞异常增生疾病，其具有复发率高和预后差的特点，且其临床治疗手段有限[1,4]。本研究发现达那唑可显著抑制MDS细胞系SKM-1细胞活性并提高细胞凋亡率，同时可显著升高TRAIL信号通路中细胞凋亡相关蛋白表达。

达那唑为合成17α-乙炔睾酮衍生物，为弱雄激素。达那唑可直接抑制卵巢甾体激素生成，使体内雌激素水平下降，临床主要用于治疗子宫内膜异位症[5,6]。现在的研究发现达那唑可增强体液免疫，这可能与达那唑具有类糖皮质激素的免疫抑制作用有关[9]。达那唑可用于治疗不适用于干细胞抑制的MDS患者[10]，然而其具体机制并不清楚。本研究结果显示，达那唑可呈梯度依赖性地抑制SKM-1细胞活力。细胞增殖依赖于细胞周期运行，阻滞细胞周期运行能抑制细胞增殖。因此，本研究进一步采用流式细胞实验检测了达那唑对SKM-1细胞的影响，结果显示，达那唑可显著降低SKM-1细胞S期比率，并使得细胞阻滞于G0/G1和G2/M期，这提示达那唑抑制SKM-1细胞活性的部分原因是由于其阻滞细胞周期。

图3 达那唑促进SKM-1细胞凋亡的TUNEL染色检测。A，代表性的TUNEL染色结果（比例尺，100μm）；B，TUNEL阳性细胞比例统计分析；与 0μmol/L 组比较：**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=3Fig. 3 TUNEL staining of the danazol promoting apoptosis in SKM-1 cells. A, representative TUNEL staining results (scale bar, 100μm); B, statistical analysis of the proportion of TUNEL staining positive cells; **0.001＜P ＜0.01, ***P ＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=3

在达那唑治疗子宫内膜异位症模型的研究中，达那唑可促进子宫异位内膜细胞凋亡[11]。因此本实验考虑，达那唑对MDS细胞活性的抑制作用是否与其促进细胞凋亡相关。另外，MDS细胞凋亡增多也是MDS治疗效果的最终体现方式之一。本研究实验结果显示，达那唑可显著增高SKM-1细胞的凋亡。细胞凋亡主要通过细胞内（内源性）和细胞外（外源性）两条通路触发。外源性途径是通过肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 或TRAIL等细胞外分子与死亡配体结合而触发，进一步导致死亡诱导信号复合物 (death-inducing signal complex, DISC) 形成并激活caspase[12-14]。Li X等[15]报道TRAIL可显著增强MDS细胞凋亡，说明TRAIL信号通路在抑制MDS中具有重要作用。目前已鉴定的TRAIL受体有5种，分别为R1、R2、H3、R4以及OPG。TRAIL与其受体结合后，可直接活化PARP和caspase-8引起细胞凋亡[16]。在本研究中，Western blot实验结果显示达那唑可使Cleaved Caspase 8表达升高，并且可引起caspase切割底物Cleaved PARP表达升高，提示达那唑可通过激活TRAIL通路引起细胞凋亡。

综上，达那唑可显著抑制MDS细胞活性并促进其凋亡，其机制可能与激活TRAIL信号通路相关。本研究结果为达那唑用于治疗MDS提供了新的理论依据。

图4 达那唑促进SKM-1细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI法流式细胞术检测。A，代表性的流式细胞术检测结果；B，细胞凋亡率的统计结果；与 0μmol/L 组比较：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=4Fig.4 Flow cytometry analysis of the danazol promoting apoptosis in SKM-1 cells. A, representative results of flow cytometry analysis. B, statistical analysis of apoptosis rate. *0.01＜P＜0.05, **0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=4

图5 达那唑对SKM-1细胞中TRAIL信号通路相关蛋白影响的Western blot检测。A，DR5、cleaved PARP、PARP、cleaved caspase-8和caspase-8水平的代表性Western blot检测；B-D，DR5/GAPDH（B）, cleaved PARP1/PARP1（C）和cleaved caspase 8/caspase 8（D）水平的统计学分析。与 0μmol/L 组比较：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=4Fig. 5 Western blot detection for the effect of danazol on the levels of TRAIL signaling pathway-related proteins in SKM-1 cells. A, representative results of the levels of DR5, cleaved PARP, PARP, cleaved caspase-8 and caspase-8 detected by Western blot; B-D: statistical analysis of DR5/GAPDH(B), cleaved PARP1/PARP1(C) and cleaved caspase 8/caspase 8(D). *0.01＜P＜0.05, **0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001, compared with the 0μmol/L group;n=4