高致病性禽流感检测方法的分析比对

文│张亦弛 吕艳秋 高晓波（北京市昌平区动物疫病预防控制中心）

高致病性禽流感是一种能引起禽类短时间内大量死亡的人畜共患病，是国家规定的一类动物疫病，它的流行对养殖业造成非常大的伤害。高致病性禽流感病毒为单股负链RNA，依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白，可分为H5亚型和H7亚型，其中H7N9和H5N1为目前我国常见的亚型。能够快速准确且便宜地诊断出高致病性禽流感是目前我国基层兽医检测部门的工作重点之一。本实验主要选用了目前商品化的禽流感检测方法进行了诊断方面的比较，为临床工作中能够高效检测禽流感病毒提供参考。

一、试验样品及采集方法

2018年，北京市昌平区某鸡场送检30只鸡的30份血清样品和对应的60份咽肛拭子样品。血清样品为采集翅静脉血后25℃温箱3小时静置后自然分离，用于血凝抑制（HI）试验；咽肛拭子一份为用棉签分别擦拭咽壁和泄殖腔壁分泌物后立刻放入干净的空试管，用于胶体金试纸条试验；另一份为咽肛拭子采集分泌物后立刻放入含有3%甘油的磷酸缓冲盐溶液（PBS）的试管中低温保存，用于实时荧光定量PCR试验。

二、主要试剂和试验方法

1.血凝抑制（HI）试验。H7N9，H5N1-R7株，H5N1-R8株禽流感（AI）抗原及阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产。试验方法和判断依据按照GB/T18936-2020《高致病性禽流感诊断技术》进行：以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数为HI滴度，HI≤3log2为阴性，HI≥5log2为阳性，HI=4log2为可疑，复检后HI≥4log2为阳性。

表1 禽流感病毒抗体血凝抑制试验结果

2.胶体金试纸条试验。禽流感病毒（AIV）通用型、H7亚型和H5亚型抗体检测试纸条由韩国某公司生产。试验方法和判断依据按照说明书进行：将咽肛拭子插入稀释液中搅拌挤压，使分泌物充分溶解，然后加3～5滴溶液到进样孔（充分浸湿即可），等待5分钟后，当质控线C和检测线T同时出现红线时为阳性，只出现质控线C呈红线为阴性，只出现检测线T为红线则试验无效。此外，10分钟后的观察结果同样视为无效。

3.实时荧光定量PCR试验（Real-time PCR）。禽流感病毒通用型、H7亚型和H5亚型实时荧光定量PCR试剂盒和核酸提取试剂盒由上海之江生物科技股份有限公司生产，试验方法和判断依据按照试剂盒说明书进行。

◎图1 胶体金试纸条检测结果

三、试验结果

1.血凝抑制（HI）试验。3个禽流感病毒抗体的阳性率为均≥90%。详细数据见表1。

2.胶体金试纸条试验。H7亚型和H5亚型均为阴性。AIV通用型有4个呈现弱阳性，复检后3个变为阴性，1个依然为弱阳性，见图1。

3.实时荧光定量PCR试验（Real-timePCR）。禽流感通用型、H7亚型和H5亚型均为阴性。

四、结果分析

1.HI抗体合格率在90%以上，说明现有H7亚型和H5亚型疫苗的免疫接种对鸡群有很好的保护作用，这种情况下出现禽流感病毒感染的概率非常低。

2.胶体金试纸条中初次检测有4个弱阳性，复检后有3个样品的复检结果和原检测结果不一致，说明胶体金试纸条检测方法有假阳性的可能。胶体金试纸条的制作原理和方法，决定了影响其敏感度的因素有很多，比如抗体特异性、包被量、膜材料、胶体金颗粒、缓冲体系等等，这些都会对最终的结果判断产生影响。

3.H7亚型和H5亚型的抗原检测结果中，胶体金试纸条和实时荧光定量PCR均为阴性，表明此30只鸡均无H5亚型和H7亚型的感染。对于禽流感通用型抗原检测，胶体金试纸条复检后依然有弱阳性，而实时荧光定量PCR为阴性。这可能是由于PCR的检测准确度和灵敏度均高于胶体金试纸条检测，可合理怀疑是胶体金试纸条检测的结果产生了假阳性，故最终的检测结果以PCR为准，为阴性。

五、结论

胶体金试纸条检测法快捷方便，时间短（5～10分钟），对仪器和环境要求低（无仪器，室温即可），但是有假阳性的风险，适合做前期筛查；实时荧光定量PCR方法准确性高，但是耗时长、对仪器和环境要求也高，而且试剂盒费用昂贵，适合筛查出疑似阳性样品后做进一步的鉴定。这样的安排更适合县/区级的动物疫控单位进行本辖区的禽流感检测。

另外，从禽流感通用型、H7亚型、H5亚型的抗原阳性和抗体保护率在90%以上可看出，疫苗免疫接种是保护鸡群不受高致病性禽流感感染的可靠方法，同时也可以辅助判断是否出现禽流感感染。