UPLC-MS/MS快速筛查豆芽中27 种植物生长调节剂和抗生素类药物

颜伟华，周 莹，郭浩炜，王笑笑

（衢州市食品药品检验研究院，浙江 衢州 324002）

豆芽，又称芽苗菜，品种丰富，营养全面，是老百姓餐桌上的常见菜。近年来豆芽涉“毒”事件屡屡发生、问题豆芽事件愈演愈烈[1-2]，相关部门对豆芽食品安全的关注和监管[3-4]也越来越大，有报道指出在豆芽生产中可能存在违法使用植物生长调节剂和抗生素类药物的现象[3-5]。植物生长调节剂如4-氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤、赤霉素等，是一类用于调节植物生长发育的农药，可促进植物生长、提高农作物的质量和产量。抗生素类药物如恩诺沙星、诺氟沙星、甲硝唑、氯霉素等，其主要目的是用于杀菌消毒和防止根部腐烂。然而植物生长调节剂和抗生素类药物的滥用，可引起人畜急慢性中毒，易导致耐药性细菌的产生，严重危害了人们的健康[6-7]。

当前豆芽中植物生长调节剂和抗生素类药物的检测方法文献均有报道[8-23]，BJS 201703（2017年第24号公告发布）采用高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中11 种植物生长调节剂，浙江省市场监督管理局制定的《关于加强生猪产品、豆芽等重点食品农产品排查治理工作的紧急通知》附件2采用了高效液相色谱-串联质谱法分别测定6 种喹诺酮化合物和甲硝唑。但检测方法多为单个或几个化合物一个方法，前处理方法繁琐耗时长，不能满足食品安全突发事件快速处置工作所要求的高效率、多组分等要求，因此选择合适的提取方法和分析手段对解决多组分植物生长调节剂和抗生素类药物的同时测定尤为重要。

依据相关文献[24-30]、日常监管需求及大量的豆芽检测经验，选择27 种生长激素和抗生素类药物作为研究对象，采用超高效液相色谱-串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法，测定豆芽中可能添加的27 种生长激素和抗生素类药物，并应用该法对259 批豆芽进行测定。本研究旨在拓展豆芽中植物生长调节剂和抗生素类药物的检测范围和深度，提高日常检测的工作效率，以期为社会食品安全共享服务提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

检测样品来自衢州市食品药品检验研究院监督抽验样品、委托样品、豆芽专项整治样品，共259 批样品。乙腈、甲醇、甲酸、正己烷均为色谱纯，其他化学试剂为分析纯，水为自制超纯水。

2,4-二氯苯氧乙酸钠（批号：C11946000）、氯吡脲（批号：C13907000）、赤霉素（批号：C14020000）、4-氯苯氧乙酸（批号：C11480000）、噻苯隆（批号：C17465000）、6-苄基腺嘌呤（批号：C10569600）、1-萘乙酸（批号：C15460000）、磺胺甲基嘧啶（批号：C16995100）、磺胺甲恶唑（批号：C16998100）、磺胺喹恶啉（批号：C16990000）、磺胺嘧啶（批号：C16990500）、磺胺邻二甲氧嘧啶（批号：C16990600）等标准品（纯度均＞98%） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；磺胺二甲嘧啶（批号：100411-200501）、磺胺间甲氧嘧啶（批号：510093-201401）、磺胺邻二甲嘧啶（批号：510095-201401）、甲硝唑（批号：100191-201507）、氯霉素（批号：130555-200602）、诺氟沙星（批号：130450-200705）、氧氟沙星（批号：130454-200202）、培氟沙星（批号：130459-201402）、洛美沙星（批号：130452-200001）、环丙沙星（批号：130451-200302）、恩诺沙星（批号：510117-201501）等标准品（纯度均大于98%） 中国食品药品检定研究院；多效唑（批号：A1708094，100%）、烯效唑（批号：A1708071，100%） 北京云墨质检科技有限公司；4-氟苯氧乙酸（批号：IST24058）、异戊烯腺嘌呤（批号：IST24059） 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LCMS-8040三重四极杆串联质谱仪（配有电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）及Labsolutions软件）日本岛津公司；XS-205电子天平 瑞士梅特勒公司；SK5200HP超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪 法国Millipore公司；X1R冷冻离心机 美国赛默飞公司；QE-100粉碎机 浙江屹立工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：A相为0.01%甲酸溶液，B相为甲醇。流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样体积1 μL[10]。流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1Gradient program of mobile phase

1.3.2 质谱条件

毛细管电压：3.5 kV；电离模式：ESI+和ESI－；扫描模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；脱溶剂气温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；干燥气流速：15 L/min；雾化气流速：3 L/min。分别对27 种标准物质的定性离子和定量离子进行质谱扫描[10-11]。

扫描方式：噻苯隆、2,4二氯苯氧乙酸钠、氯吡脲、赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、异戊烯腺嘌呤、1-萘乙酸、氯霉素采用负离子模式扫描；甲硝唑、多效唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲嘧啶、磺胺邻二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、烯效唑采用正离子模式扫描。

1.3.3 标准品溶液的制备

精密称取27 种标准品各约20 mg，分别置于10 mL量瓶中，100%甲醇超声处理15 min，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得标准品储备溶液。精密量取以上标准储备溶液适量置同一量瓶中，用甲醇稀释，配制成10～200 µg/mL的混合标准品溶液，并用初始流动相逐步稀释至质量浓度分别为10、25、50、100、200 ng/mL（其中赤霉素、1-萘乙酸质量浓度均为100、250、500、1 000、2 000 ng/mL）的混合标准品溶液。

1.3.4 供试品溶液的制备

将豆芽切碎后用组织粉碎机充分粉碎混匀，准确称取5.0 g试样，置于50 mL具塞离心管中，加入10 g无水硫酸钠，立即涡旋混合1 min，加入20 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，称量，超声15 min，用乙酸乙酯补足质量后，12 000 r/min离心5 min，精密移取上清液10.0 mL于45 ℃水浴中氮吹至干，用甲醇定容至1 mL，涡旋混匀1 min，上清液经0.22 µm有机相滤膜过滤后，取续滤液供UPLC-MS/MS测定，并视情况进一步稀释。

1.4 数据处理

采用Labsolutions软件（岛津公司）进行UPLC-MS/MS图谱分析，Microsoft Excel统计处理，SPSS 21.0软件进行差异显著性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 分析条件的选择

2.1.1 提取溶剂的优化

考虑到27 种植物生长调节剂和抗生素类药物的快速筛查需要通用、快速、回收率优化的前处理方法，本方法选取27 种植物生长调节剂和抗生素类药物中比较典型或回收率较差的4-氯苯氧乙酸、赤霉素、甲硝唑、诺氟沙星、磺胺间甲氧嘧啶5 种化合物作为依据，样品在相同加标量20 μg/kg的情况下，分别考察乙腈、1%酸化乙腈、乙酸乙酯不同提取液的回收率，结果如图1所示。使用乙酸乙酯作为提取溶液时，4-氯苯氧乙酸、赤霉素、甲硝唑、诺氟沙星、磺胺间甲氧嘧啶回收率稳定，均为80%以上。

图1 不同提取溶剂的回收率Fig.1 Recoveries of analytes with different extraction solvents

2.1.2 净化条件的优化

样品在使用相同提取试剂和相同加标量20 μg/kg的情况下，选取27 种植物生长调节剂和抗生素类药物中比较典型或回收率较差的5 种化合物作为依据，分别考察正混合型阳离子交换柱净化、QuEChERS离心管（300 mg无水硫酸镁和100 mg C18）净化、不净化3 种方式对5 种化合物回收率的影响，结果如图2所示。

图2 净化方式对回收率的影响Fig.2 Recoveries of analytes with different clean-up methods

综上所述，由于豆芽基质较干净，选择乙酸乙酯作为提取溶剂，不经净化，目标化合物的回收率均在80%以上，不仅操作方便快速，而且提高了目标化合物的回收率，更加适合日常检验中豆芽27 种植物生长调节剂和抗生素类药物快速筛查。

2.1.3 流动相的选择

比较甲醇与乙腈两种有机相对27 种植物生长调节剂和抗生素类药物分离效果的影响，结果表明：使用乙腈为有机相时，大多数化合物分离效果略优于甲醇，但甲硝唑、磺胺嘧啶等部分化合物出锋时间过早且易出现分叉峰，故采用甲醇为有机相。比较6 种水相（水、0.01%甲酸溶液、0.1%甲酸、0.02%甲酸溶液、0.15 mmol/L乙酸铵溶液、0.01%甲酸-0.15 mmol/L乙酸铵溶液）对27 种植物生长调节剂和抗生素类药物分离效果的影响，结果表明：使用纯水溶液为水相时，大部分化合物出现分叉拖尾现象；0.01%甲酸溶液能够显著改善氧氟沙星等喹诺酮类化合物，随着甲酸含量的增大，虽然能进一步改善喹诺酮类化合物的峰形，但明显降低了1-萘乙酸的峰响应值；0.15 mmol/L乙酸铵溶液可显著改善甲硝唑、多效唑的峰形，却使得氧氟沙星等喹诺酮类化合物峰形变差，峰面积大大降低，同时也降低了赤霉素等部分负离子模式下的化合物的峰响应值；0.01%甲酸-0.15 mmol/L乙酸铵作为水相，赤霉素、2,4-二氯苯氧乙酸钠的响应较低。在不同流动相下，部分化合物的峰面积见表2。结合27 种植物生长调节剂和抗生素类药物的整体响应，优先考虑受甲酸、乙酸铵流动相影响较大的1-萘乙酸、赤霉素、氧氟沙星、2,4-二氯苯氧乙酸钠的原则下，最终选择0.01%甲酸溶液-甲醇作为流动相，得到标准溶液总离子流色谱分离图见图3。

表2 水相对化合物峰面积的影响Table 2Effect of aqueous phase composition on peak areas of analytes

图3 27 种化合物的总离子流图Fig.3 Total ion current chromatograms of 27 reference compounds

2.1.4 质谱条件的优化

在1.3.1节条件下，优化脱溶剂温度、碰撞能量、喷针位置等参数，最终确定17 种化合物采用正离子模式可获得较好的灵敏度和稳定性，10 种化合物采用负离子模式可获得较好的灵敏度和稳定性。在相应模式下做选择提取离子扫描，选择灵敏度高、稳定性和重复性好的提取离子作为定量离子，次之的作为定性离子。27 种化合物的电离方式、定量离子、定性离子、碰撞能量及保留时间见表3。

表3 27 种化合物定量离子、定性离子、碰撞能量及保留时间Table 3Mass spectral parameters and retention times for 27 compounds

2.2 方法学考察结果

2.2.1 专属性

将1.3.3节质量浓度为100 ng/mL混合标准品溶液，按1.3.1、1.3.2和1.3.4节色谱条件和质谱条件进样测定，得到标准品总离子流图，见图3。取不含27 种化合物的豆芽按1.3.4节方法处理并测定，阴性样品色谱图上均无干扰。

2.2.2 检出限和定量限

取不含27 种化合物的豆芽加入混合标准品溶液，经稀释后进样，以信噪比为3和信噪比为10时分别计算各成分的检出限和定量限。检出限为0.5～50 μg/kg，定量限为1.5～150 μg/kg，见表4。结果显示该方法具有较高的灵敏度，能够满足豆芽中27 种植物生长调节剂和抗生素类药物快速筛查的检测要求。

表4 27 种化合物线性范围、相关系数、检出限、定量限、回收率、重复性及精密度Table 4Linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs,recoveries, repeatability and precision for 27 compounds

2.2.3 线性范围

将1.3.3节系列质量浓度为10、25、50、100、200 ng/mL（其中赤霉素、1-萘乙酸质量浓度均为100、250、500、1 000、2 000 ng/mL）的混合标准品溶液，按1.3.1、1.3.2和1.3.4节色谱条件和质谱条件进样测定，以27 种化合物的定量监测离子对色谱峰峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，得线性回归方程和相关系数（R2），见表4。结果表明27 种化合物R2≥0.998 5，在对应线性范围内质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度实验结果

将1.3.3节质量浓度为100 ng/mL混合标准品溶液，按1.3.1、1.3.2和1.3.4节色谱条件和质谱条件平行测定6 次，各成分含量的相对标准偏差为1.1%～3.5%（n＝6），见表4。结果显示该方法精密度良好。

2.2.5 加样回收实验结果

以不含任何化合物的豆芽为基质，采用3 个水平（10、20、100 ng/mL）或（100、200、1 000 ng/mL）添加混合标准品溶液，按1.3.4节方法处理并且进行测定，回收率范围为80.5%～114.9%，回收率良好，见表4。

2.2.6 稳定性实验结果

取2.2.5节第1个水平（10 ng/mL或100 ng/mL）的供试品溶液，在配制后分别放置0、4、8、12、24 h，1.3.1、1.3.2和1.3.4节色谱条件和质谱条件进行测定，各成分含量的相对标准偏差为1.3%～4.6%。结果显示供试品溶液24 h内稳定。

2.3 与现有推荐方法比较

日常监管中，豆芽植物生长调节剂和抗生素类药物含量检测方法主要有3 种。第1种是BJS 201703（2017年第24号公告发布）推荐的豆芽中11 种植物生长调节剂的测定方法，试样经含1%甲酸-乙腈溶液匀浆提取，固相萃取净化，UPLC-MS/MS上机；第2种是浙江省市场监督管理局制定的《关于加强生猪产品、豆芽等重点食品农产品排查治理工作的紧急通知》附件2中推荐的豆芽中6 种喹诺酮类药物的测定方法，试样经酸化乙腈提取并浓缩，经正己烷液-液萃取净化后，UPLC-MS/MS上机；第3种与第2种出自同一文件，为豆芽中甲硝唑的测定方法，试样匀浆后用乙酸乙酯提取，用混合型阳离子交换柱净化后，UPLC-MS/MS上机。

上述3 种方法检测的化合物共计18 种，且需进行3 次不同的前处理。本方法的试样直接用乙酸乙酯提取净化，无需过净化柱，不仅前处理步骤简单，并且一次完成对27 种目标化合物提取检测，有效提高了日常检测的工作效率。

2.4 样品测定结果

利用建立的UPLC-MS/MS快速筛查豆芽中27 种植物生长调节剂和抗生素类药物法对衢州市食品药品检验研究院2018—2019年度的监督抽验样品、委托样品、豆芽专项整治样品，共259 批样品进行测定。检出情况如下：4-氯苯氧乙酸67 批，6-苄基腺嘌呤29 批，赤霉素2 批，恩诺沙星18 批，氧氟沙星1 批，噻苯隆7 批，1-萘乙酸8 批，甲硝唑14 批。其中4-氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤、赤霉素与现有的豆芽中植物生长调节剂的测定（BJS 201703）方法进行比较，恩诺沙星、氧氟沙星、甲硝唑与浙江省市场监督管理局制定的《关于加强生猪产品、豆芽等重点食品农产品排查治理工作的紧急通知》附件2进行比较，结果表明，本方法前处理更加简单，阳性检出率为100%，漏检率为0%。实际样品测定的结果见表5。

表5 实际样品的检验结果Table 5Results of detection of actual samples

3 结 论

经过对大量豆芽进行检测，发现豆芽中添加的植物生长调节剂和抗生素类药物比较复杂，本实验从相关文献[24-30]及实践工作经验中重新确定并扩大了目标化合物范围。除检出已有推荐标准中4-氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤、赤霉素、恩诺沙星、氧氟沙星和甲硝唑等化合物，在259 批豆芽中还检出了噻苯隆和1-萘乙酸。该方法在15 min内完成对27 种目标化合物的定性定量，与现有推荐方法相比，本方法更快捷，容量更大，适用范围更广，更适合用于豆芽食品中安全风险突发事件的快速应急处置工作。