薄层色谱法快速鉴别保健食品中非法添加非苯二氮䓬类化合物的研究

林凤屏，翁 嘉，李惠敏

（惠州市食品药品检验所，广东 惠州 516003）

非苯二氮䓬类药物（non-benzodiazepines,NBZD）是直接作用于中枢神经系统的抑制剂，属于第三代镇静催眠药。该类药物于二十世纪八十年代末期发展迅速，主要代表药物有唑吡坦、扎来普隆、佐匹克隆，具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥、肌肉松弛等药理作用，主要用于治疗失眠[1-3]。这类药物对苯二氮䓬受体（BZ）具有特异选择性，具有快速进入睡眠状态，促进深度睡眠，正常睡眠生理结构基本不受影响，醒后无宿醉感等特点。因其用量少，催眠效果好，起效快，一些不法分子在安神类保健食品中非法添加此类药物。非苯二氮䓬类药物属于第二类精神药物，需在医生的指导下服用，滥用或长期使用均会对身体造成不同程度的伤害。

目前测定非苯二氮䓬类药物一般采用高效液相色谱、高效液相色谱-质谱/质谱联用或超高效液相色谱质谱/质谱联用技术[4-8]，以上方法均需对样品进行前处理，各种实验耗材消耗大，检验时限长，不利于日常快速检测，高效监管。

本文探索利用薄层色谱法（TLC）对安神类保健食品中非法添加非苯二氮䓬类药物进行鉴别，以实现快速筛查，提高监管效率，打击不法行为。

1 材料、仪器和试药

1.1 材料

1.1.1 样品信息 安神类的保健食品65批次，均由市场购买。

1.1.2 对照品信息 佐匹克隆对照品（批号：100870-200801），酒石酸唑吡坦对照品（批号：171258-200601），扎来普隆对照品（批号：100670-200401）均购于中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器和试剂试药

硅胶预制板（烟台市化学工业研究所，型号SGF254100×100、GF25410×5，涂层厚度0.20±0.03 mm，粒度10～40 µm）；自制GF254薄层板（规格20 cm×10 cm，青岛海洋化工有限公司，批号060818，涂层厚度0.5 mm）；AE-240电子分析天平：瑞士Mettler；数码成像系统：瑞士CAMAG；高效液相色谱仪：Agilent 1200 Serie；1100 series/API 3000液质联用仪：美国安捷伦/美国ABI公司；KQ-250超声波清洗器（250 W，40 kHz）：昆山市超声仪器有限公司。

甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 酒石酸唑吡坦、扎来普隆、佐匹克隆薄层色谱鉴别

取1片（粒）样品的内容物，加乙酸乙酯3 ml，振摇提取1 min使溶解，静置，取上清为供试品溶液；同时分别取佐匹克隆、酒石酸唑吡坦、扎来普隆对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液，吸取上述溶液各5～10 µl，点于硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（17:2:6）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，不应显相同颜色的荧光斑点。

2.2 方法学考察

2.2.1 对照品顺序 混合对照品溶液从下至上分别为：佐匹克隆、酒石酸唑吡坦、扎来普隆（见图1）。

图1 对照品顺序

2.2.2 耐用性

2.2.2.1 不同薄层板的比较 取自制薄层板与市售薄层板，分别按拟定的方法试验。结果表明，不同薄层板色谱不影响结果判断。

2.2.2.2 不同温度的比较 取点样后的薄层板，分别在2 ℃和32 ℃中展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果表明在2～32 ℃范围内试验，对检查无明显的影响。

2.2.2.3 不同湿度的比较 取点样后的薄层板，分别在用硫酸调节相对湿度32 %和88 %的层析缸中展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果表明在相对湿度32 %～88 %之间试验，对检查无明显的影响。

2.2.2.4 饱和与不饱和的考察 取点样后的薄层板，分别在展开前饱和10 min和立即放入展开，取出、检视。结果表明两者没有区别，所以在检查中可不需要饱和。

方法学验证结果表明，薄层板方面自制薄层板分离效果与市售薄层板相差不大，而温湿度变化对展开效果影响不大，因此认为本方法耐用性良好。

2.2.3 检出限 取佐匹克隆对照品、酒石酸唑吡坦对照品、扎来普隆对照品分别加乙酸乙酯制成系列浓度溶液进行试验，点样量均为1 μl。结果当佐匹克隆对照品浓度为0.0629 mg/ml、扎来普隆对照品浓度为0.0614 mg/ml、酒石酸唑吡坦对照品浓度为0.0324 mg/ml时，对照品的荧光淬灭斑点仍然可见，故认为方法的检出限分别为佐匹克隆62.9 μg/ml、扎来普隆61.4 μg/ml、酒石酸唑吡坦32.4 μg/ml。

依据佐匹克隆片（胶囊）、酒石酸唑吡坦片、扎来普隆片（胶囊）的国家标准[8]及说明书，佐匹克隆最低临床剂量为3.75 mg，酒石酸唑吡坦最低临床剂量为5 mg，扎来普隆最低临床剂量为5 mg。由表1可见，本方法的检出限低于最低临床剂量的十分之一，故认为对于非法添加上述3种成分，均可检出，且鉴别快速。

表1 佐匹克隆、扎来普隆、酒石酸唑吡坦的检出限与最低临床剂量

2.2.4 不同点样量 取佐匹克隆、酒石酸唑吡坦、扎来普隆3种对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml分别含1，0.2，1 mg的混合溶液，分别吸取上述对照品溶液2～14 μl点于同一薄层色谱板上，按拟定的方法展开、检视。结果4 μl点样量所显斑点可见，而6 μl点样量所显斑点清晰，能满足观察需要。考虑到不同样品添加的量不一致，视样品情况选择5～10 µl作为薄层色谱检查的点样量。

3 结果与分析

3.1 薄层色谱结果

65批次样品经2.1项方法处理，展开，显色后，结果呈阳性的有4批次样品，怀疑添加佐匹克隆化学成分（见图2）。

图2 阳性样品图谱

3.2 高效液相色谱（HPLC-DAD）结果

65批次样品经高效液相色谱法进行测定，结果有4批次样品的供试品色谱中，显与佐匹克隆保留时间相同的色谱峰，采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰的紫外-可见吸收光谱，结果吸收光谱与佐匹克隆一致。高效液相色谱法与薄层色谱法检测结果一致。

3.3 液质联用仪分析结果

4批次初筛呈阳性的样品采用液质联用仪分析方法进行分析，结果所得的质谱图与佐匹克隆对照溶液的质谱图一致，高效液相色谱法所确认的添加成分与质谱结果一致。

4 讨论

通过薄层色谱法，对市售的65批次安神类保健食品进行筛查，发现4批次样品添加了佐匹克隆，检测结果与高效液相色谱、液质联用仪结果一致。佐匹克隆为处方药，必须在医生指导下服用，佐匹克隆所致不良反应，包括味觉障碍、谵妄、昏迷、严重激越、记忆损害、睡行症、呼吸抑制、急性胰腺炎、急性间质性肾炎、戒断症状、过敏反应等[9-11]，由于保健食品中非法添加的药物剂量不明确，具有很大的潜在危险。

对于怀疑添加非苯二氮䓬类化合物的样品，本方法操作简便、结果准确，既可节约时间、成本，又能准确快速筛查出阳性样品，在打击药品、保健食品违法添加化学成分不法行为中有广阔的应用前景。