溴结构域蛋白4的抑制策略及其在肿瘤治疗中的研究进展

刘晓庆，梁 爽，刘永军，张 娜

（山东大学药学院，天然产物化学生物学教育部重点实验室，济南250012）

表观遗传调控是一种不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要的作用，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA及染色质重塑等［1-2］。其中，组蛋白修饰构成了一类超越基因序列的组蛋白密码，控制着遗传信息的表达。组蛋白赖氨酸乙酰化是组蛋白尾部的主要修饰之一，乙酰化赖氨酸的识别是其参与表观遗传调控的关键步骤［1，3］。溴结构域是组蛋白中乙酰化赖氨酸的“阅读器”［1］，存在于8个亚家族的46种蛋白质中［4］。其中，溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是溴结构域和超末端结构域家族中最重要的蛋白，与其他3个成员BRD2、BRD3和BRDT相比，BRD4研究最为广泛［5］。BRD4在多种肿瘤细胞中过度表达［6-7］，识别组蛋白乙酰化赖氨酸并与之结合，招募染色质调控因子，促进基因转录，促进肿瘤的发生、发展和转移［8］。因此，开发BRD4的抑制策略是表观遗传药物研究中极为重要的一部分。

1 BRD4的结构及在肿瘤中的作用

1.1 BRD4的结构

BRD4由两个保守的溴结构域（BD1、BD2）和一个超末端结构域（ET）构成［1］，根据氨基酸链的长度可分为3个亚型（图1-A），分别为富含脯氨酸结构域的长亚型BRD4A和短亚型BRD4B、BRD4C［5］。溴结构域由4个反向平行的α螺旋αZ、αA、αB和αC构成，形成ZA环和BC环（图1-B）［9］。两个环中的氨基酸残基形成一个疏水空腔，可识别并以氢键形式结合乙酰化赖氨酸残基，进而调控相关功能。BRD4被形象地称为乙酰化赖氨酸表观遗传“阅读器”［10］。

1.2 BRD4在肿瘤中的作用

BRD4在多种肿瘤中过度表达，如黑色素瘤、卵巢癌等［6-7］，促进肿瘤的发生、发展和转移。BRD4在肿瘤中的作用主要有：①促进c-Myc基因、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因等的转录，促进肿瘤细胞增殖；②上调肿瘤细胞中PD-L1的表达，加剧免疫抑制；③修复损伤DNA；④促进端粒延伸。

BRD4识别染色质上乙酰化的组蛋白赖氨酸，并作为支架将RNA聚合酶Ⅱ、正性转录延伸因子b、转录中介体亚基等募集到活性基因的启动子和增强子上，刺激转录的起始和延伸［11］。BRD4驱动C-MYC、BCL-2等关键致癌基因的转录，使其过度表达，从而加速肿瘤增殖和发展［12］。还可与多种G1基因启动子结合来刺激G1基因表达，调控细胞周期，促进细胞增殖［13］。另外，BRD4在肿瘤细胞的CD274基因（编码PD-L1）启动子处富集，促进CD274基因转录而上调PD-L1。BRD4基因敲除可有效降低BRD4和PD-L1表达，表明BRD4与肿瘤细胞PD-L1水平的增加息息相关，BRD4会加剧肿瘤的免疫抑制［14］。Andrieu等［15］证实BRD4能调节三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）PD-1/PD-L1轴，上调T细胞PD-1和TNBC细胞PDL1的表达，促进肿瘤免疫逃逸。

BRD4不仅是DNA修复系统中多种基因的主调控子，激活DNA损伤检查点，还以转录独立的方式修复损伤DNA［16］。C-末端结合蛋白相互作用蛋白（C-terminal binding protein interacting protein，CtIP）是受损DNA同源重组修复的关键蛋白，BRD4通过调控CtIP表达，促使肿瘤细胞修复损伤DNA［17］。乙酰化组蛋白在损伤的DNA处聚集并招募BRD4，BRD4作为支架稳定P53结合蛋白53BP1，进而激活损伤DNA的修复和组装［18］。因此，抑制BRD4可导致或加剧DNA损伤，为肿瘤治疗提供了新的思路。端粒长短影响细胞增殖速度。端粒上积累的乙酰化组蛋白招募BRD4，促进端粒保护复合物的组装，增强端粒酶活性，从而促进端粒延长，加速肿瘤增殖［16，19］。

Figure 1 Structures of bromodomain-containing protein 4(BRD4)(A)[5]and crystal structure of bromodomain(B)[9]

2 BRD4的抑制策略

BRD4对肿瘤发生发展的促进作用使其成为肿瘤治疗中极具研究价值的靶点之一。采用合适的策略抑制肿瘤细胞中过度表达的BRD4，是肿瘤治疗新的切入点。研究表明，多种BRD4抑制剂和BRD4降解剂均具有良好的抗肿瘤效果。

2.1 BRD4抑制剂

近年来，大量BRD4抑制剂被开发出来，代表性BRD4抑制剂的化学结构见图2。已有多种处于临床试验阶段（表1），表现出良好的应用前景。根据BRD4抑制剂与溴结构域的相互作用方式，可将其分为两类：一价型和二价型。一价型BRD4抑制剂与单个溴结构域结合，而二价型BRD4抑制剂能够同时结合两个溴结构域。

Figure2 Structures of some BRD4 inhibitors and crystal structure of JQ1-BRD4

Table 1 BRD4 inhibitors in clinical trails[4,8,11]

目前，一价型BRD4抑制剂最为常见。Beren⁃guer-Daizé等［20］发 现 三 氮 唑 类BRD4抑 制 剂OTX015可导致细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，经口给予OTX015可显著提高U87MG异种移植小鼠的存活率。在OTX015的血液恶性肿瘤Ⅰ期临床试验中（NCT01713582），口服剂量从10 mg/d增加到160 mg/d（3周为一疗程，前2周给药），最终确定了其安全给药剂量为80 mg/d，作为Ⅱ期临床试验的推荐剂量［21］。治疗过程中，部分患者出现血小板减少、胃肠道毒性、胆红素升高、疲劳等轻中度不良反应［21］。这些不良反应是可控的，且随着治疗的中断而消退。TEN-010的Ⅰ期临床试验（NCT01987362）采用皮下给药方式，剂量从0.03 mg/kg增加到0.85 mg/kg（3周为一疗程，前2周给药）。接受高剂量治疗（0.45 mg/kg）的患者均有不同程度的肿瘤消退。CPI-0610是一种异噁唑类BRD4抑制剂，已经完成多发性骨髓瘤、淋巴瘤的Ⅰ期临床试验，与鲁索替尼联合治疗多种肿瘤的Ⅰ、Ⅱ期临床试验正在进行中。在CPI-0610的淋巴瘤Ⅰ期临床试验中（NCT01949883），评估了从6 mg/d增加到300 mg/d（3周为一疗程，前2周给药）的口服剂量。结果显示，CPI-0610耐受性良好，最大耐受剂量是225 mg/d，不良反应与OTX015类似，在晚期淋巴瘤患者中具有抗肿瘤活性［22］。在多发性骨髓瘤细胞中，CPI-0610抑制Ikaros家族锌指蛋白1、干扰素调节因子4和致癌基因MYC的表达，通过G1细胞周期阻滞和半胱氨酸蛋白酶依赖的凋亡途径对肿瘤细胞产生强大的毒性［23］。

AZD5153是一种新型二价型BRD4抑制剂，可同时结合BRD4中的两个溴结构域，具有更强的抗肿瘤活性，正在进行Ⅰ期临床试验（NCT03205176、NCT03527147）。AZD5153抑制Myc、E2F和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamy⁃cin，mTOR）信号通路，在急性髓系白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤的异种移植模型中显著抑制肿瘤生长［24］。Shen等［25］发现，AZD5153下调前列腺癌细胞中细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、Myc、Bcl-2、FOS样抗原1（FOSL1）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的表达，引起细胞周期阻滞和细胞凋亡。进一步研究表明，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）是AZD5153的主要耐药因子，AZD5153处理前列腺癌异种移植小鼠可抑制肿瘤的生长，联合AKT抑制剂MK-2206可进一步增强抗肿瘤活性。另外，AZD5153可下调肿瘤相关巨噬细胞上PD-L1的表达，并使其从M2型向M1型转化，同时增强CD8+T细胞的活化，从而重塑卵巢癌中的免疫微环境［26］。

BRD4抑制剂竞争性结合BRD4的乙酰赖氨酸结合位点，阻断BRD4与组蛋白乙酰化赖氨酸的结合，拮抗BRD4对肿瘤发生发展的促进作用。2010年，Filippakopoulos等［9］报道了第1个三氮唑类BRD4抑制剂JQ1，它在多项研究中均表现出良好的抗肿瘤活性，Maggisano等［27］制备了包载JQ1的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒N-JQ1。用N-JQ1处理三阴性乳腺癌细胞后，可显著降低细胞活力，减少细胞迁移。为了改善JQ1半衰期短的问题，研究人员对其叔丁酯基进行结构修饰，得到一系列药效持久且抑制活性较好的BRD4抑制剂。三氮唑 类BRD4抑 制 剂（JQ1、OTX015、TEN-010、IBET762等）三氮唑环上的3位氮原子与乙酰化赖氨酸识别口袋的Asn140以氢键方式结合，2位氮原子与Tyr97通过水分子以氢键相连，氯苯基位于WPF区域（ZA环、BC环和αZ形成），通过疏水作用与BRD4结合［1，3］（图2）。研究表明，该类抑制剂三氮唑环上的3位氮原子与Asn140形成氢键是BRD4抑制活性所必需的；三氮唑环上的甲基作为最优基团与BRD4的甲基疏水空腔结合，若以其他基团取代，与BRD4的结合能力则大大下降；氮杂䓬环上的侧链也会影响化合物与BRD4的结合能力［28］。氯苯基是与WPF区域结合能力最好且有较低不良反应的官能团，决定了BRD4抑制剂对BRD4的选择性。基于此，以对羟基苯羧酰胺取代JQ1氮杂䓬环上的叔丁酯侧链，得到OTX015，其IC50为92～112 nmol/L，抑制活性较JQ1（IC50为77 nmol/L）略有降低，但半衰期有所延长［8］。以酰胺替换酯基，化合物的抗水解能力增强，TEN-010和I-BET762的稳定性较JQ1大大提高。此外，IBET762稠合芳环上的甲氧基也关系着与BRD4的结合能力。

异噁唑类BRD4抑制剂（CPI-0610，PLX51107等）的异噁唑环上的氧原子与Asn140以氢键方式结合，所以该氧原子是BRD4抑制活性所必需的。CPI-0610对BD1的IC50为39 nmol/L，具有良好的药代动力学参数；PLX51107与BD1或BD2结合，Kd分别为1.7 nmol/L和6.1 nmol/L，是一种有效的BRD4抑制剂［4］。PFI-1是一种喹啉酮类BRD4抑制剂，喹啉酮中的羰基氧及氮氢同时与Asn140形成氢键，从而与BRD4结合。PFI-1对白血病细胞具有活性，但其有效性比JQ1低［8］。Gosmini等［29］经构效关系分析，得到抑制活性很强的四氢喹啉类BRD4抑制剂I-BET726，其乙酰基上的氧、羧基分别与Asn140、Tyr97形成氢键，此外，甲基的构象也对BRD4抑制活性影响较大。I-BET726可强效抑制神经母细胞瘤细胞的增殖，IC50为75 nmol/L［29］。乙酰吡咯类BRD4抑制剂（如XD14）与BRD4的作用方式与上述各类抑制剂略有不同，XD14的羰基氧与Asn140和Tyr97形成氢键，吡咯环的氮原子与Pro82以氢键结合，苯磺酰胺与WPF区域形成CH-π共轭，增强了与BRD4的结合能力［3，8］。Tanaka等［30］以聚乙二醇将两个JQ1分子连在一起，开发了一种二价型BRD4抑制剂MT1，其对BD1的IC50为0.789 nmol/L，大大提高了抗肿瘤活性。

2.2 BRD4降解剂

BRD4降解剂可有效诱导BRD4降解，在抑制肿瘤细胞生长和促进细胞凋亡方面比相应的BRD4抑制剂更有效，是一种极具前景的BRD4抑制策略。基于蛋白水解靶向嵌合分子（protein proteolysis-targeting chimeras，PROTACs）技术开发的BRD4降解剂由3部分组成：BRD4抑制剂、E3泛素连接酶配体和连接链［31］。BRD4降解剂分别与BRD4和E3泛素连接酶结合，形成一种三元复合物，诱导BRD4泛素化，进而使BRD4被蛋白酶体降解，发挥抗肿瘤作用［4］（图3）。近年来，研究人员设计出一系列BRD4降解剂（图4），根据E3泛素连接酶的类型，可将其分为两类：基于CRBN（Cul4-Rbx1-DDB1-cereblon）的BRD4降解剂和基于VHL（Von Hippel-Lindau）的BRD4降 解剂［4］（表2）。

基于CRBN的BRD4降解剂主要有dBET1和ARV-825等。dBET1是由JQ1和沙利度胺合成得到的，以人白血病细胞MV4-11荷瘤小鼠为模型评价其体内效果，发现可显著抑制肿瘤生长［32］。ARV-825是由OTX015和泊马度胺（pomalidomide）合成的另一个BRD4降解剂，研究表明ARV-825可将BRD4招募到E3泛素连接酶上，使Burkitt淋巴瘤细胞中的BRD4快速降解，抑制下游c-Myc表达，且与OTX015相比，其抑制增殖和诱导凋亡的能力更强［33］。He等［34］研究发现，ARV-825可诱导甲状腺癌细胞中BRD4蛋白降解进而下调c-Myc、Bcl-xL和cyclin D1的表达。体内研究表明，经口给予ARV-825能显著抑制TPC-1异种移植小鼠肿瘤的生长。最近，基于光控释放的新型BRD4降解剂受到研究人员青睐。Xue等［31］和Liu等［35］将4，5-二甲氧基-2-硝基苄基盐酸盐作为光活性部分修饰到dBET1上，分别得到化合物pc-PROTAC和optodBET1，实现了dBET1在365 nm光照下的特异性释放，以减轻全身给药时的不良反应。这为新型BRD4降解剂的开发提供了重要参考。

以肿瘤抑制蛋白VHL为E3泛素连接酶设计的BRD4降解剂也具有良好的抗肿瘤效果。MZ1由JQ1和VH-032连接而成，与dBET1相比，它可优先降解BRD4，表现出良好的选择性。Raina等［36］利用OTX015和VHL-2合成得到另一种BRD4降解剂ARV-771。在去势抵抗前列腺癌细胞中，ARV-771降解BRD4，抑制雄激素受体FL-AR和AR-V7的表达。体内抑瘤实验表明，ARV-771可抑制22Rv1异种移植小鼠肿瘤的生长。Sun等［37］研究发现ARV-771对BRD4的降解能力比ARV-825更强，且与OTX015相比，ARV-771能显著延长套细胞淋巴瘤MCL Z138异种移植小鼠的生存期。

3 在肿瘤联合治疗中的应用

抑制BRD4可抑制肿瘤细胞中关键基因的转录，阻止DNA损伤修复，下调PD-L1表达，从而抑制肿瘤的增殖和转移。多项研究表明，将BRD4抑制策略与其他治疗方法联合应用，协同不同的治疗机制，产生更好的治疗效果（图5）。

3.1 BRD4抑制与化学治疗

Figure3 Mechanism of BRD4 degraders[4,31]

Figure 4 Structures of some BRD4 degraders

Table 2 BRD4 degraders and their components

化疗药物直接杀伤肿瘤细胞，在临床肿瘤治疗中应用广泛。BRD4抑制剂与化疗药物联用，是一种极具临床治疗潜力的策略。烷化剂破坏肿瘤细胞DNA，BRD4抑制剂阻止DNA损伤修复，二者联合使用，可加剧DNA损伤。Lam等［38］开发了一种共载替莫唑胺和JQ1的转铁蛋白功能化纳米粒（Tf-NP），利用共载两药的Tf-NP处理胶质瘤荷瘤小鼠后，DNA损伤标志物和细胞凋亡标志物增加，小鼠存活率显著高于单独给药组。I-BET762与吉西他滨联用在胰腺癌荷瘤小鼠中显著降低了肿瘤体积和质量，表现出比单药更好的效果［39］。IBET762诱导胰腺癌细胞G0/G1期细胞周期阻滞，抑制转移干细胞因子，上调与化疗耐药相关的唯BH3蛋白Bim的表达，可协同吉西他滨发挥细胞杀伤作用，同时延缓耐药。Wang等［40］制备了共载紫草素和JQ1的乳铁蛋白仿生纳米粒（Man-LFNPs），紫草素诱导ICD效应，JQ1下调PD-L1的表达，二者协同激活免疫系统，提高抗肿瘤能力。在以CT26荷瘤小鼠为模型的体内抑瘤实验中，Man-LF NPs组抑瘤率为84%，两游离药混合组和紫草素单药组分别为61%和45%，说明共载两药的Man-LF NPs比两药单独使用有更好的抗肿瘤效果。

Figure 5 Mechanism of combination therapy with BRD4 inhibitors

3.2 BRD4抑制与光热治疗

近红外光照射后，光热剂产生的热可杀伤肿瘤细胞，还能产生ICD效应，激活肿瘤免疫。BRD4抑制联合光热治疗，可以强化机体免疫应答，协同消灭肿瘤细胞。Wang等［41］将JQ1和吲哚菁绿共载于自体肿瘤细胞并以水凝胶包封，获得疫苗PVAX，用于术后肿瘤治疗。在808 nm近红外光照射下，4T1荷瘤小鼠体内的吲哚菁绿产热破坏肿瘤细胞，触发肿瘤抗原释放，激活机体抗原递呈与免疫治疗；同时PVAX释放JQ1，下调PD-L1表达，增强CD8+T细胞活性，增强免疫治疗效果。另有研究发现，负载JQ1的聚多巴胺纳米粒（PDMN-JQ1）对治疗PD-L1抗体反应有限三阴性乳腺癌具有积极意义［42］。JQ1抑制BRD4-c-Myc轴，下调PD-L1的表达，载体聚多巴胺可发挥光热治疗作用。用药物处理4T1荷瘤小鼠后，PDMN-JQ1组的抑瘤效果明显优于游离的JQ1组（P=0.02）和单独的PD⁃MNs组（P=0.02）。PDMN-JQ1同时发挥了c-Myc靶向治疗、光热治疗和免疫治疗的作用，这种治疗策略具有推广到其他实体瘤治疗的潜力。

3.3 BRD4抑制与免疫治疗

BRD4抑制可下调PD-L1的表达，解除肿瘤细胞的免疫抑制，与免疫检查点阻断剂联合，具有巨大的潜力和临床应用价值。将JQ1与CTLA-4单抗联合使用能有效治疗前列腺癌［43］。JQ1阻断CD274编码的PD-L1表达，增加肿瘤MHC-I的递呈，增强CD8+T细胞作用，与CTLA-4单抗联合使用对DU145和PC3异种移植小鼠的抑瘤效果更好，延长了荷瘤小鼠生存期。Hogg等［44］将JQ1和PD-1单抗联合用于淋巴瘤荷瘤小鼠，与单独用药组相比，联合用药组可显著延长小鼠生存期，表明联合治疗可协同激活免疫。

3.4 BRD4抑制与分子靶向药物

多项研究表明，BRD4抑制剂与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂、共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关 激 酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related，ATR）抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclindependent kinases 2，CDK2）抑制剂等分子靶向药物联合使用，可增强抗肿瘤效果。Fehling等［45］研究了BRD4抑制剂JQ1或I-BET762与PARP抑制剂奥拉帕尼或维利帕尼联用对于胆管癌细胞系的影响，发现JQ1使c-Myc及其下游靶点Chk1的表达下降，DNA损伤标志物γH2AX增加，而PARP抑制剂抑制DNA损伤修复，联合使用产生协同毒性作用。体内抑瘤实验表明，JQ1和奥拉帕尼同时使用可显著抑制KKU-055胆管癌荷瘤小鼠肿瘤的生长。BRD4抑制剂RVX2135可增强细胞对ATR抑制剂AZ20的敏感性，二者联合使用可加剧DNA损伤，协同诱导淋巴瘤细胞死亡，抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长［46］。CDK2抑制剂Milciclib和JQ1联用可共同抑制c-Myc的表达，引起细胞周期阻滞和细胞凋亡，联合治疗显著延长了髓母细胞瘤GTML2同种异体移植小鼠的生存期［47］。

4 耐药性

抑制BRD4的策略虽然具有确切的抗肿瘤作用，但是在白血病、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中显示出一定的耐药性。主要表现为对c-Myc等肿瘤相关基因抑制效率降低、诱导肿瘤细胞凋亡能力不强和抗增殖活性低下等［4］。耐药机制之一是肿瘤细胞相关基因转录的恢复。Rathert等［48］发现，持续使用JQ1可通过Wnt信号通路代偿性上调c-Myc，使治疗效果下降。在三阴性乳腺癌中，蛋白磷酸酶2A下调而导致的BRD4过磷酸化可恢复BCL2L1/BCL-XL基因转录，产生对BRD4抑制剂的耐药现象［49］。另外，肿瘤细胞BRD4的积累也可产生耐药性。例如，核受体辅阻遏物2-组蛋白去乙酰化酶10-去泛素化酶3-溴结构域蛋白4（nuclear receptor corepressor 2-histone deacetylase 10-deubiq⁃uitylating enzyme 3-bromodomain-containing protein 4，NCOR2-HDAC10-DUB3-BRD4）信 号 通 路 中NCOR2-HDAC10复合物的破坏会引起BRD4上调［50］。一些肿瘤中，NCOR2基因缺失或突变使去泛素化酶DUB3过度表达，拮抗E3-泛素连接酶介导的BRD4的泛素化降解，使BRD4水平升高。斑点型锌指结构蛋白/BRD4信号轴的阻断也会引起BRD4无法通过泛素化降解而上调，抵抗以BRD4为靶点的治疗手段诱导的细胞生长停滞和凋亡［51］。

5 总结展望

本文介绍了BRD4的结构及其在肿瘤中的作用，综述了BRD4的抑制策略、在肿瘤联合治疗中应用以及耐药性的研究进展。BRD4抑制剂和降解剂可强效抑制BRD4，进而抑制肿瘤细胞增殖，促进免疫杀伤，具有良好的抗肿瘤活性。目前，OTX015、CPI-0610、AZD5153等多种BRD4抑制剂已经进入临床研究阶段；将BRD4抑制与化学治疗、光热治疗、免疫治疗等联合用于肿瘤治疗，可产生协同抗肿瘤作用，极具临床应用前景。

虽然BRD4的抑制策略已取得很多进展，但仍有一些问题需要解决：一是临床试验中患者具有轻中度的不良反应，可进一步进行结构改造或开发安全性更好的BRD4抑制剂；二是积极开发二价型BRD4抑制剂和新型BRD4降解剂，提高抗肿瘤活性；三是持续用药产生耐药性，应深入研究其耐药机制并找寻降低耐药性的方法；再者，结合纳米药物递送系统，实现体内靶向递送，提高治疗效果。相信在不久的将来，靶向BRD4的治疗策略会在临床肿瘤治疗中发挥更大的作用。