基于蛋白互作和关键作用靶点的网络药理学研究当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症的作用机理

张水冰，李 颖，赵思怡，黄 帆，海那尔·乌拉孜巴依，丘明旺，方婉仪，姚 琳，张茂祥

（广州中医药大学，广州 510405）

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是由于纤维环无法限制椎间盘内容物即髓核的突破，进而压迫腰椎神经根和硬膜囊，早期引起腰痛继而可能发展为坐骨神经痛的腰椎间盘退行性异常综合征［1］。近年有研究表明，腰椎间盘突出症的发病率居于椎管疾病的第一位［2］。在英国每年约有三分之一的人受腰痛折磨［3］。但是目前关于腰椎间盘突出症的发病机制尚未阐明，其临床主要表现为腰痛、腿痛、神经功能障碍等症状［3-4］。中医认为腰椎间盘突出症属于“筋病”、“腰痛”、“痹症”的领域，最早见于《素问·脉要精微论》：“腰者肾之府，转摇不能，肾将惫矣”，《素问·五常政大论》也有相关论述“湿气下临，肾气上从，当其时反腰椎痛，动摇不便也”。

当归四逆汤（Danggui-Sini Decoction，DSD）自于张仲景所著的《伤寒论》，其条文分别在辨厥阴病篇和附篇《辨不可下并脉证并治第二十》中记载。当归四逆汤由当归三两、桂枝三两(去皮)、芍药二两、甘草二两(炙)、细辛三两、通草二两、大枣二十五枚(擘)组成，主要功效为温通经脉、驱散内寒、调养精血［5］。现代研究中当归四逆汤具有治疗糖尿病周围神经病变、冠心病、消化性溃疡、肩周炎、颈椎病、血栓闭塞性脉管炎、雷诺氏病、痹症等疾病的功效［6-8］。临床观察显示，当归四逆汤对治疗腰椎间盘突出症有着明显作用［9-12］。

网络药理学主要研究药物作用靶点、功能及作用通路以推断出药物所能达到的理想疗效和作用机理。中药复方涉及多种药物，通过药物靶点之间的共同作用达到疗效。网络药理学的给药思路和中药的复方给药本质殊途同归，利用网络药理学可以帮助了解当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的机制,并为腰椎间盘突出症新疗法的开发探索提供思路。

1 材料与方法

1.1 当归四逆汤作用靶点的获取

当归四逆汤方由当归、桂枝、白芍、甘草、细辛、通草、大枣七味药物组成。通过检索中药系统药理学技术平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP ；https://tcmspw.com/）和中药潜在靶点数据库（the petental target data base of traditional Chinese medicine，TCM-PTD ；http://tcm.zju.edu.cn/），找到当归四逆汤的活性成分，并根据药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的标准进行筛选，得到当归四逆汤的有效活性成分。

在TCMSP中检索有效活性成分相关靶点。将得到的当归四逆汤作用靶点与UniProt（https://www.uniprot.org/）数据中的靶点名称相匹配，得到作用靶点名简称。

1.2 腰椎间盘突出症相关作用靶点获取及筛选

人类基因GeneCards数据库（http://www.genecards.org/）能提供靶点、靶点与疾病的关系等多种信息。孟德尔疾病基因OMIM数据库（https://omim.org/）含有已知的孟德尔疾病、15 000条基因信息和人类关注的表型和基因型之间的关系。在GenCards数据库和OMIM数据库中以“lumbar disc herniation”、“LDH”为关键词检索与腰椎间盘突出症相关的疾病靶点，并除去重复数据。

1.3 当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点的获取

为明确腰椎间盘突出症疾病相关靶点与当归四逆汤复方潜在靶点之间的相互作用关系，将腰椎间盘突出症靶点与当归四逆汤潜在靶点进行交集，以获取药物疾病共同作用靶点。利用 ClusterProfiler R 语言编程软件绘制Venn图，得到当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点。

1.4 药物活性成分-靶蛋白-疾病共表达网络的构建与分析

将当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点和活性成分与潜在作用靶点的关系输入Cytoscape Version 3.6.1软件，构建活性成分-靶点网络。

1.5 蛋白-蛋白互作网络的构建与分析

STRING平台（https://string-db.org/，version11.0）是一种包含已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库，其中收集了大量的蛋白相互作用关系。将筛选得到的疾病-药物成分共同靶蛋白导入STRING功能性蛋白质关联网络平台，限定物种为人类，最低相互作用阈值设为高等“medium confidence”（Score≥0.4）获取蛋白互作关系（protein-protein interaction，PPI）。使用Cytoscape 3.6.1软件对获得的PPI蛋白互作网络进行拓扑分析。

将得到的蛋白互作关系表格使用ClusterProfiler R软件进行分析注释，对蛋白互作网络中与其他靶点关联性较强的靶点进行排序，得到核心靶点的信息。

1.6 基因本体论（GO）富集分析

为了阐明当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症潜在靶点在基因功能层面上发挥的作用，使用ClusterProfiler R软件对当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析，将结果可视化。

1.7 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

使用ClusterProfiler R软件中BioConductor平台的“clusterProfiler”功能对当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并将结果可视化。将结果导入Cytoscape Version 3.6.1软件构建“活性成分-靶点-通路”网络图。

1.8 分子对接

采用AutoDock vina软件对上述分析后得出的关键靶点及活性分子进行对接验证。

2 结果与分析

2.1 当归四逆汤活性成分和作用靶点的获取

通过TCMSP、TCM-PTD检索，OB≥30%、DL≥0.18进行筛选，得到细辛有效活性成分8个，通草有效活性成分4个，桂枝有效活性成分7个，甘草有效活性成分4个，当归有效活性成分2个，大枣有效活性成分15个，白芍有效活性成分13个，去除重复的有效成分，得到当归四逆汤的有效活性成分45个，详见表1。

表1 当归四逆汤的活性成分Tab.1 Active ingredients of Danggui-Sini Decoction

根据得到的有效活性成分，在TCMSP数据库检索得到细辛作用靶点164个，通草作用靶点6个，桂枝作用靶点74个，甘草作用靶点106个，当归作用靶点69个，大枣作用靶点113个，白芍作用靶点123个，去除重复靶点，得到当归四逆汤的作用靶点164个，与Uniprot数据库中载入的靶点简称进行基因名称匹配，最终得到当归四逆汤的作用靶点132个，详见表2。可见当归四逆汤的活性成分较多且复杂，具有较强的药物利用价值，多靶点多通路共同作用于疾病。本文对当归四逆汤作用靶点及活性成分进行整理，有助于相关试验的进一步开展。

表2 （续）Tab.2 (continued)

表2 当归四逆汤作用靶点Tab.2 Targets of DSD

2.2 腰椎间盘突出症作用靶点的筛选

在GenCards数据库和OMIM数据库中以“lumbar disc herniation”、“LDH”为关键词检索与腰椎间盘突出症相关的疾病靶点并除重复基因后，得到疾病作用靶点379个。

2.3 当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点的获取

将当归四逆汤的作用靶点和腰椎间盘突出症的相关靶点输入ClusterProfiler R软件绘制Venn图，左边蓝色代表腰椎间盘突出症相关靶点，红色代表当归四逆汤药物作用靶点，阴影部分表示两者的共有靶点，见图1。得到当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点25个，见表3。潜在作用靶点为我们研究的重点，可提示药物治疗疾病的关键信息。

表3 当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在靶点Tab.3 DSD acts as a potential target for lumbar disc herniation

图1 当归四逆汤-疾病共有靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of the common targets between DSD and disease

2.4 构建药物活性成分-靶蛋白-疾病共表达网络

采用 Cytoscape 3.6.1软件构建当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症的活性成分-靶蛋白-疾病共表达网络图，其中当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症相关的有效活性成分有8种（蓝色菱形代表），分别是paeoniflorin、beta-sitosterol、kaempferol、(+)-catechin、stigmasterol、formononetin、licochalcone a、sesamin，共同作用于25个共同靶点（绿色方形节点代表），见图2。网络图显示出当归四逆汤发挥作用时呈现出多成分、多靶点的特点。且beta-sitosterol、kaempferol、sesamin连接靶点较多，可视为药物作用的关键成分。

图2 当归四逆汤“活性成分-疾病靶蛋白”网络图Fig.2 The “drug active component-disease target” network of DSD

2.5 蛋白-蛋白互作网络的构建与分析

将通过筛选获取的疾病和药物成分共同靶蛋白在STRING平台构建蛋白-蛋白相互作用网络PPI模型。将蛋白种类设置为人类，最低相互作用阈值设为中等“medium confidence”（0.4），其余值不做修正，获取PPI蛋白互作网络图，见图3。

图3 当归四逆汤与腰椎间盘突出症蛋白-蛋白互作网络Fig.3 The protein-protein interaction network of DSD and LDH

再应用 Cytoscape 3.6.1中的cytohHubba插件绘制靶蛋白-蛋白互作网络拓扑分析图，见图4。图中节点颜色随着Degree值的增大而颜色加深，Degree平均值为14.64。结果提示：当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症的靶标中Degree值从大到小排列，值较大的10个靶蛋白为IL6、AKT1、PTGS2、MAPK1、STAT3、MAPK8、JUN、CASP3、MAPK14、IL10。具体结果见图4。

图4 蛋白-蛋白互作网络拓扑分析图Fig.4 Protein-protein interaction network topology analysis diagram

将蛋白互作关系使用ClusterProfiler R软件进行分析注释，根据相连靶点的数目（Count）进行排序，结果显示，当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症的靶标中Count值排名前十的靶蛋白为IL6、AKT1、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、CASP3、JUN、IL10、MAPK14，具体见图5。PPI中Degree值可提示该靶点在网络中联系广，信度高。Count值提示相连靶点数目较多，二者结合可得出当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的关键靶点：IL6、AKT1、MAPK1、MAPK14、STAT3、MAPK8、CASP3、IL10。

图5 蛋白-蛋白互作网络注释分析Fig.5 Annotation analysis of protein-protein interaction network

表4 共同靶点的GO功能富集分析Tab.4 The GO analysis of co-target protein

2.6 GO功能富集分析

使用ClusterProfiler R软件对当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的潜在作用靶点进GO功能富集分析，探究当归四逆汤治疗疾病的可能作用机制。设置物种为人类，P<0.05，共得到44条结果，其中包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活性、半胱氨酸型内肽酶（cysteine endopeptidases，CE）活性参与凋亡过程、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶（serine proteinases/ threonine/tyrosine kinase）活性、血红素结合/核受体活性/转录因子活性、直接的配体调节序列特异性DNA结合、细胞因子受体结合、RNA聚合酶II转录因子结合、磷酸酶结合、黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）结合等，见表5。并将结果用气泡图表示，横坐标表示该通路富集的靶点数目占总数的比例，纵坐标为功能名称，圆点大小表示富集的靶点数目多少，圆点越大则表明该功能上的靶点数目越多，圆圈的颜色表示调整后P值（Padjust）大小，由蓝到红调整后P值逐渐减小，详见图6。

图6 共同靶点的GO功能富集分析（前20）Fig.6 The GO analysis of co-target protein（Top 20）

2.7 KEGG通路分析

使用 ClusterProfiler R软件对当归四逆汤与腰椎间盘突出症的共同靶点进行KEGG通路富集分析，以调整后P值为筛选条件，筛选出作用通路共17条，包括缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、FoxO（forkhead box O3）信号通路、内分泌抵抗、铂耐药、鞘脂信号通路、MAPK信号通路、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂、ErbB（verb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog）信号通路、精氨酸生物合成、p53信号通路、环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶 G（cGMP-PKG）信号通路、核因子激活的B细胞的κ-轻链增强（NF-κB）信号通路、Rap1信号通路、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路、卵母细胞减数分裂、精氨酸和脯氨酸代谢、大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）信号通路，具体见表5。绘制气泡图，纵坐标表示功能名称，横坐标为富集的靶点数目，颜色表示调整后P值，由蓝到红P值逐渐减小，见图7。

图7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

表5 KEGG通路富集分析Tab.5 KEGG pathway enrichment analysis

将所得通路输入Cytoscape3.6.1，输出“活性成分-靶点-通路”网络图，椭圆形表示通路，三角形表示活性成分，箭形表示靶点，关联的节点数目越多则形状越大，见图8。

图8 “活性成分-靶点-通路”网络图Fig.8 “Active ingredient-target-path” network diagram

2.8 分子对接

选取上述分析后得出的IL6和AKT1 2个关键靶蛋白进行对接验证，见图9、10。

图9 IL6与paeoniflorin 分子对接图Fig.9 Molecular docking diagram of IL6 and paeoniflorin

IL6与paeoniflorin对接后显示，paeoniflorin提供了4个氢键结合位点，分别为GLN156、ASP160、GLU106、SER107，氢键较多提示结合部位较为紧密。AKT1与kaempferol对接显示，kaempferol提供了2个氢键结合位，分别是CYS310、TYR326，且根据3D全景图可见，AKT1结合位点分裂为2个部分，结合结构相对较为复杂。

3 讨论

腰椎间盘突出症的患者病因相对复杂，现代研究认为发病机制主要包括腰椎间盘退行性改变、急性损伤、慢性劳损、炎症化学刺激、自身免疫反应的作用等［13-16］。本研究采用网络药理学的方法研究当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症的潜在靶点和作用机制。结果显示，药物含有25个潜在作用靶点。蛋白-蛋白互作网络分析表明，IL6、AKT1、PTGS2、MAPK1、STAT3、MAPK8、MAPK14等靶点存在协同作用，提示该方剂在治疗腰椎间盘突出症中具有多组分、多靶点、多功能、多通路的复合型特点。白细胞介素-6（Interleukin-6，IL6）是T细胞和巨噬细胞所衍生的趋化因子族群中的一种细胞因子，并作为重要的中枢基因参与相位反应的产生、调节身体免疫系统以及运动期间的新陈代谢等生物活动［17］。试验研究对腰突和正常组织进行检测后发现，IL6表达阳性细胞在突出腰椎间盘周围的炎性肉芽组织中表达最强，因此IL6为腰椎间盘突出症疼痛产生的关键因子［18］。本研究显示，IL6与芍药苷（paeoniflorin）存在相互作用关系，提示paeoniflorin可能为当归四逆汤抑制腰椎间盘突出症的关键化学成分。AKT1参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。近年来的试验研究表明AKT1在血管损伤中起着重要作用［19］。腰椎间盘压迫刺激血管导致神经根局部供血障碍、炎性水肿和酸性代谢产物积聚，使神经根传导功能下降，是腰椎间盘突出症引发腰腿痛的主要原因［20］。FoxO1作为由AKT1调控的转录因子［21］，同时也是成骨细胞增殖和氧化还原平衡所需的唯一因子，可控制骨的形成。AKT1主要通过PI3K/AKT途径使FoxO1磷酸化，失去调控成骨细胞生长的能力［22］。这与本研究证实FoxO信号通路为当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症关键信号通路的结论相吻合。AKT1与山萘酚（kaempferol）相互作用，并且通过PI3K/AKT途径影响FoxO1治疗腰椎间盘突出症，这为腰椎间盘突出症新药的研究带来新的启示。

KEGG代谢通路富集分析和GO功能富集分析结果表明，当归四逆汤治疗主要通过MAP激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、血红素结合、磷酸酶结合、氧化还原酶活性、FMN结合、内肽酶活性、激素结合等功能治疗腰椎间盘突出症，涉及 HIF-1、FoxO、NF-κB、MAPK、p35等信号通路。HIF-1的活性对于组织缺血后的恢复十分重要。HIF-1能够通过上调与血管系统相关的蛋白基因表达，如使血管生成更多的内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体和诱导型一氧化氮合酶等来抑制缺血损伤［23］，同时通过与靶点VEGF、STAT3相关联，在缺氧的条件下促进破骨细胞的产生［24］。NF-κB信号通路在损伤应答、炎症反应及免疫调控等病理方面具有重要作用。动物试验表明，抑制NF-κB信号通路可下调炎性因子的表达水平，从而达到缓解疼痛的作用［25-27］。有研究显示，HIF-1可以通过抑制NF-κB信号通路使破骨细胞延迟分化或不分化，从而抑制破骨的吸收［28］。同时提示，STAT3可能与腰椎间盘突出症中骨的吸收与再生相关，其相关活性成分甘草查尔酮a（licochalcone a）可为新药的开发提供思路。MAPK通路同样可以诱导各种促炎因子［29］，下调MAPK活性，抑制MAPK通路可以达到缓解炎症的作用。最新研究表明，FoxO信号通路可以通过调节T细胞建立功能适应性免疫系统，以抵抗细胞损伤，能够为药物医治腰椎间盘突出症带来新的提示［30］。

药物成分-靶点-通路网络分析结果显示，当归四逆汤活性成分中的山奈酚、β-谷甾醇（β-sitosterol）靶点数目最多，提示这些活性成分可能参与了当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症的过程。本研究结果表明，当归四逆汤中山奈酚、β-谷甾醇等成分对IL6、AKT1、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、CASP3、JUN、IL10、MAPK14等相关靶点通过HIF-1、FoxO、内分泌抵抗和MAPK等信号通路以抑制缺血损伤、下调炎性因子、构建免疫系统等功能作用于腰椎间盘突出症。

综上，本研究揭示了当归四逆汤作用于腰椎间盘突出症的靶点、通路及作用机制，利于临床进行参考应用，同时为新药开发提供思路。