水禽H6N6亚型禽流感病毒在猪和人的肺组织中的复制能力的体外研究▲

林裕贵 庞夏凤 李程颐 孙增辉 朱银川 王熹婧 林春秀 张增峰

(1 广西医科大学微生物学教研室，南宁市 530021，电子邮箱：18324180870@163.com；2 江南大学食品学院，江苏省无锡市 214122)

研究表明，H6N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)已经在欧亚地区的野禽和家禽中广泛流行，其感染宿主的范围不断扩大，从主要感染水禽逐渐进化为感染陆禽、哺乳动物，甚至具有感染人类的潜能[1]。前期研究结果显示，陆禽H6N6亚型AIV已经具备感染哺乳动物猪及人类的潜能[2-3]。水禽鸭、鹅在流感病毒生态系统中起非常重要的作用，然而水禽H6N6亚型AIV是否具有感染哺乳动物猪及人类的潜能，目前仍未完全清楚。本研究将前期分离出的2株水禽流感病毒鸭H6N6亚型AIV A/DK/GX/750/2010(简称GX750)、鹅H6N6亚型AIV A/GS/GX/399/2010(简称GX399)，进行基因测序和遗传进化分析，以了解其基因来源和基因特点，然后通过体外感染猪肺和人肺组织来检测病毒的复制能力和组织病理改变，旨在探讨水禽H6N6亚型AIV感染哺乳动物猪及人类的潜能及其跨物种传播风险，为H6N6亚型AIV的监测和防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验毒株及组织标本 两株H6N6亚型AIV GX750、GX399分离于2010年广西南宁市活禽交易市场；选择先前已证实能在猪和人肺组织有效地复制的H9N2亚型AIVA/DK/GX/767/2010(简称GX767)作为阳性对照病毒株。将病毒接种于10日龄的无特定病原体级鸡胚(广西富凤农牧集团有限公司)进行扩增，采用血凝试验和半数组织培养感染试验(50%tissue culture infective dose,TCID50)分别检测病毒滴度和感染力(见表1)。新鲜猪肺组织取自4～5月龄的无特定病原体级巴马香猪(广西大学动物遗传育种与繁殖研究所)，新鲜人肺组织取自广西医科大学第一附属医院肺组织切除手术标本，所需组织标本均获广西医科大学实验动物伦理委员会和广西医科大学医学伦理委员会审批同意，所有实验均在生物安全二级实验室中进行。

表1 实验毒株的基本资料

1.2 主要试剂 MEM培养基、F12-K培养基、胎牛血清、TPCK-胰酶购自Gibco公司(批号：1810992、1854888、1715752、1832635)；链-青霉素购自Solarbio公司(批号：20160817)；免疫组化试剂盒、苏木精染液、伊红染液、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)、枸橼酸盐抗原修复剂购自福州迈新生物技术开发有限公司(批号：1703249720、141201445V、1001036198、17030701、1114AD23)；4%多聚甲醛购自Biosharp公司(批号：1608145)；小鼠源核蛋白抗体购自厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心；TRIzol购自Thermo公司(批号：50175111)；反转录试剂PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、PCR反应试剂PremixEx TaqTMVersion 2.0、DNA Marker试剂100 bp DNA Ladder购自TaKaRa公司(批号：AK2601、A120806A、100-55-2)；DNA胶回收试剂EasyPure® Quick Gel Extraction Kit购自TransGen公司(批号：L41118)；0.6%火鸡红细胞悬液由广西医科大学微生物教研室自配。

1.3 实验方法

1.3.1 病毒基因测序：采用TRIzol法提取病毒RNA，采用国家流感中心提供的甲型流感病毒基因引物，反转录合成病毒cDNA；使用PCR反应试剂进行PCR扩增及DNA电泳，DNA胶回收试剂回收电泳胶进行DNA纯化，采用Illumina公司Solexa系统进行全基因组测序。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 遗传进化分析：应用BLAST程序对两株H6N6亚型AIV的8个基因片段进行比对，应用MEGA 7.0软件，以GenBank数据库http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html中的相关流感病毒为参考序列，采用最佳模型和最大似然法(参数设置为1000 replications) 绘制病毒基因的系统进化树，以进行遗传进化分析。

1.3.3 病毒体外感染肺组织：采集新鲜猪肺和人肺组织标本，用F-12K培养基反复冲洗，然后切除可疑病变组织，将剩余正常组织切成数块，每块体积约0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm。体外感染前每种标本随机留取两块组织，分别行流感病毒核蛋白检测和病毒分离培养，以明确本实验所选取的组织无流感病毒感染。每种标本随机选择6块组织分别置于4个6 mm培养皿中(3个感染组和1个空白组)，每1个感染组的培养皿接种1株病毒，分别加入2 mL含TCID50为106/mL的病毒的F-12K培养基，37℃、5% CO2吸附2 h，同时用F-12K培养基代替病毒液作为空白对照组。吸附完成后组织经PBS反复冲洗3次后置于6孔板中，每孔放入2块组织，用1 mL含0.2%TPCK-胰酶和1%链-青霉素的F-12K培养基37℃、5%CO2继续培养，分别在接种后24 h、48 h、72 h随机收获一孔中的组织和培养上清液。其中，1块组织加入4%多聚甲醛浸泡固定24 h，另1块组织经PBS反复冲洗3次后研磨为组织匀浆液。组织研磨液和培养上清液分别接种于10 d鸡胚进行病毒培养，然后行血凝试验检测病毒滴度。

1.3.4 观察组织病理改变：组织经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡，苏木精染液染色2 min、盐酸酒精脱色、自来水返蓝、伊红染液染色3 min、梯度酒精脱水，光学显微镜下观察、拍照。

1.3.5 免疫组化检测病毒核蛋白的表达：组织经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡，经3% H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，柠檬酸钠缓冲液高温高压修复抗原，山羊血清封闭非特异性位点结合位点，滴加一抗核蛋白抗体(1 ∶2 000)4℃过夜孵育，滴加生物素标记山羊抗兔/鼠IgG二抗，滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，二氨基联苯胺显色、苏木素复染。用PBS代替一抗作阴性对照。阳性结果为镜下呈棕黄色，主要位于细胞核，少量存在于核周细胞质。

2 结 果

2.1 基因测序和遗传进化分析结果 目前，H6亚型AIV可分为欧亚谱系和北美谱系，欧亚谱系可进一步分为Ⅰ组(ST339-like)、Ⅱ组(ST2853-like)、Ⅲ组(HN573-like)3个主要分支[4]。遗传进化分析结果表明，两株H6N6亚型 AIV GX750、GX399为同一重配病毒的不同变型，8个基因片段均来源于欧亚谱系的水禽源进化分支，HA基因属于Group-Ⅱ(ST2853-like)主要分支中的A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)分支(图1)，NA基因属于A/duck/Guangxi/GXd-4/2009(H6N6)分支(图2)；其余内部基因中，PA基因属于A/duck/Guangxi/052/2010(H6N5)分支，NP、NS基因属于A/duck/Guangxi/058/2010(H6N6)分支，M基因属于A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)分支，PB1基因属于A/duck/Guangdong/S1663/2009(H6N6)分支，PB2基因属于A/duck/Henan/S4179/2009(H4N6)分支。

图1 AIV GX750和AIV GX399 的HA基因进化树

图2 GX750和GX399 的NA基因进化树

2.2 体外感染猪肺和人肺组织后病毒分离培养结果 病毒感染前采集的新鲜猪肺和人肺组织均未分离、检测出流感病毒，表明本实验所采集的新鲜猪肺和人肺组织均未被流感病毒感染。两株H6N6亚型AIV GX750、GX399体外感染猪肺和人肺组织后将组织匀浆及培养上清液接种于10 d鸡胚，收获尿囊液，采用血凝试验检测病毒滴度。结果显示，水禽两株H6N6亚型AIV体外接种猪和人的肺组织后24 h、48 h、72 h，病毒分离培养均呈阳性(见表2)，表明两株水禽源性H6N6亚型AIV可在哺乳动物猪和人的肺组织有效地复制。

表2 两株水禽H6N6亚型AIV接种猪肺和人肺组织后在鸡胚分离培养的病毒滴度

2.3 体外感染猪肺和人肺组织后肺组织病理变化和流感病毒核蛋白组织嗜性 苏木精-伊红染色结果显示，3个时间点均可见猪肺组织和人肺组织感染病毒后呈现出不同程度的病理改变，猪肺组织表现为肺泡腔内少量肺泡细胞坏死脱落，人肺组织则表现为肺泡结构破坏和较多肺泡细胞坏死脱落以及炎症细胞浸润。H6N6亚型AIV GX750、GX399体外感染猪肺组织后，两株病毒在猪肺组织内均出现核蛋白表达，主要表达部位为肺泡细胞和肺泡巨噬细胞；H6N6亚型AIV GX750、GX399体外感染人肺组织后，两株病毒在人肺组织同样出现核蛋白表达，主要表达部位为肺泡细胞和肺泡巨噬细胞(图3)。

图3 两株H6N6亚型AIV体外接种猪肺和人肺组织后的核蛋白免疫组化检测结果

3 讨 论

H6亚型AIV最初主要流行于野生水禽，随后逐渐蔓延至鹅、家鸭、鸡、鹌鹑等家禽，随后在我国猪群中分离出了H6N6亚型流感病毒[5]。目前，在我国家禽中主要流行H6N2和H6N6，而H6N6已逐渐取代H6N2成为H6优势亚型[6]。值得注意的是，2013年中国台湾地区发生了首例人感染H6N1亚型AIV病例，表明H6亚型AIV可以实现跨种间屏障直接感染人类，其对人类健康和公共卫生安全的潜在威胁不容忽视[7]。目前认为，禽流感病毒和人流感病毒分别主要与唾液酸SA-α-2,3Gal受体和SA-α-2,6Gal受体结合而感染对应的宿主细胞，其中SA-α-2,3Gal受体主要分布在人下呼吸道组织的肺泡、细支气管及终末细支气管，而SA-α-2,6Gal受体则主要分布于上呼吸道组织的气管、支气管，这种受体在呼吸道分布的生理结构差异被认为是AIV跨种间屏障感染人类的主要障碍[8]。水禽是流感病毒的天然宿主，从禽类、人类和其他哺乳动物所分离得到的流感病毒几乎都来源于水禽，因此水禽AIV是不同动物流感病毒的先祖[9]。研究表明，中间宿主猪是AIV突破“禽类-人类”种间传播障碍的重要宿主，猪的不同呼吸道结构中均同时存在两种流感病毒唾液酸受体，可同时感染禽流感病毒和人流感病毒，不同来源的流感病毒在猪体内发生重配和适应性突变，使其对人的感染能力增强[10]。此外，陆禽(如鸡、鹌鹑等)也可充当AIV进化过程中的中间宿主，全球首例人感染H6N1亚型AIV以及近几年流行的H7N9、H5N6 亚型AIV的基因均在鸡体内发生重配而产生[11-13]。但水禽H6N6亚型AIV是否可以感染哺乳动物猪尚未清楚。本研究选择的两株H6N6亚型AIV GX399、GX750分别分离于水禽鹅、鸭，遗传进化分析表明其内部基因均来源于水禽流感病毒，可作为水禽H6N6亚型AIV的研究毒株。本研究将两株水禽H6N6亚型AIV体外感染猪肺组织，结果显示，在感染后不同时间点，猪肺组织匀浆液和培养上清液的病毒分离培养均呈阳性；核蛋白是流感病毒核糖核蛋白的主要成分，参与核内病毒RNA的转录和胞质病毒蛋白的翻译[14]，免疫组化检测结果提示猪肺组织的病毒核蛋白均呈阳性，阳性细胞主要是肺泡细胞和肺泡巨噬细胞，表明病毒可在猪肺组织中有效地复制，其主要复制部位为肺泡组织；苏木精-伊红染色后观察到猪肺组织出现肺泡细胞坏死及肺泡破坏，表明水禽H6N6亚型AIV感染猪肺部后可以引发肺组织损伤以及炎症反应，具有一定的致病性。因此，水禽H6N6亚型AIV具有感染哺乳动物猪的潜能，水禽H6N6亚型AIV反复感染猪可以产生适应性突变或与其他亚型病毒基因重配，一旦病毒进化为能与人型SA-α-2,6Gal受体结合，极有可能可以直接感染人类。

为进一步探讨水禽H6N6亚型AIV是否具有感染人类的潜能，本研究应用水禽H6N6亚型AIV体外接种人肺组织，结果显示，人肺组织匀浆、培养上清液的病毒分离培养均为阳性，免疫组化检测结果显示肺泡细胞和肺泡巨噬细胞内病毒核蛋白阳性，人肺部组织出现细胞坏死脱落伴有炎症反应等病理改变，表明水禽H6N6亚型AIV可在人肺组织中有效地复制，提示该类病毒具有感染人的潜能。

综上所述，在体外，水禽H6N6亚型AIV在哺乳动物猪和人的肺组织中具有较好的复制能力，提示该病毒可以打破传统的流感进化演变途径，由水禽源流感病毒直接跨种属感染哺乳动物，甚至可以直接跨种属感染人类。因此，必须加强水禽H6N6亚型AIV的监测，密切关注水禽H6N6亚型AIV的流行及进化变异状况。