小麦直链淀粉-单甘酯-色氨酸三元复合物的制备及分析

杨留枝， 娄雪， 史苗苗， 闫溢哲， 王菲， 刘延奇

(郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450002)

淀粉是小麦粉的主要组成成分，在面制品加工过程中与蛋白质、多糖以及维生素等不同组分之间相互作用，发生物理化学性质改变，从而对面制品的质量、风味、营养价值和保质期等指标产生影响，如提高面条的筋力和耐煮性、改变面包烘培的品质、增加饼干的口感与韧弹性等[1-3]。PARADA等[4]研究表明，食物中淀粉与脂类和蛋白质相互作用形成的复合物会改变淀粉消化率以及其在血糖反应中的作用。

淀粉与脂质之间能够通过络合作用形成复合物，降低淀粉的溶解度和溶胀力，抑制淀粉的回生，提高糊化温度，降低淀粉对酶解的敏感性及增加淀粉糊的最终黏度[5]。同时，淀粉与氨基酸之间也能形成复合物，在高直链小麦淀粉中添加氨基酸，可以增加淀粉的热稳定性，使食品完整性更高，抗消化性更强[6]。目前，关于淀粉复合物的研究主要集中在淀粉和脂质以及淀粉和蛋白质的二元复合物上，而对于淀粉、脂质和蛋白质三元复合物的研究较为少见。CHAO等[7]研究表明，淀粉与脂质在β-乳清蛋白的作用下能形成二元以及三元复合物，且三元复合物比二元复合物更加有序，焓值也更高。脂质结构是影响三元复合物形成的关键因素。不饱和度低的脂肪酸有利于三元复合物的形成，同时脂肪酸链越长，不饱和度越低，三元复合物的热稳定性越高[8]。单硬脂酸甘油酯,简称单甘酯(glycerin monostearate, GMS)，溶解性和乳化能力较好，是较为常见的食品乳化剂，也被认为是最安全的食品添加剂[9]。GMS含有2个亲水性羟基和1个亲油性羟基，容易与直链淀粉形成复合物[10]。GMS链长相对来说较长，不饱和程度较低，有利于增加三元复合物的热稳定性[11]。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，包括必需氨基酸和非必需氨基酸，可通过各类食品如全麦粉获取[12]。色氨酸是芳香族氨基酸，属于必需氨基酸，不能被人体自身合成，只能通过食物获取；色氨酸是人体重要的营养补充剂，既可以用于调节精神状态，改善睡眠质量，也可用于补充妊娠期妇女和婴幼儿的营养；色氨酸还具有抗氧化功能，与褪黑激素的产生有关[13]。目前，色氨酸产品形式较为单一，少见与其他物质复合[14]。因此，本研究从配体用量、制备条件等方面，经X-射线衍射(diffraction of X-rays，XRD)测定，以相对结晶度为指标，系统探究无水乙醇体积分数、色氨酸质量和单甘酯质量对小麦直链淀粉-单甘酯-色氨酸三元复合物(以下简称三元复合物)结晶结构及其结晶度的影响，其结果有助于优化新食品的生产和开发，为面制品营养和品质的提升提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

小麦淀粉购自美国Sigma公司；L-色氨酸购自天津市科密欧试剂有限公司；GSM购自广东光华化学厂有限公司，化学纯；溴化钾购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯；其他试剂购自天津市大茂化学试剂厂，分析纯。

1.2 仪器与设备

高速离心机，LG10-2.4A，北京医用离心机厂；冷冻干燥机，Scientz-10N型，宁波新芝生物科技有限公司； X-射线衍射仪，Bruker D8型，德国布鲁克公司；傅里叶红外光谱仪，Bruker TENSOR27型，德国布鲁克公司；拉曼光谱仪，Acton Spectra Pro500i型，雷尼绍贸易有限公司；差示扫描量热仪，Q20型，美国TA公司；扫描电子显微镜，Philips XL-3型，日本日立公司。

2 试验方法

2.1 小麦直链淀粉的制备

盐酸酸解小麦淀粉3 d，随后用氢氧化钠中和，过滤收集的固体样品经干燥、糊化、离心处理，得到的上清液在-18 ℃下冷冻结晶，然后在25 ℃下融化并溶入冰水混合物中，过滤得到小麦微晶淀粉，即小麦直链淀粉，具体方法见参考文献[15]。

2.2 三元复合物的制备

取1.0 g小麦直链淀粉，20 mL蒸馏水,按照m(淀粉/g)∶V(水/mL)=1∶20于三口烧瓶中制备淀粉溶液，并加入不同质量的色氨酸加热至沸腾，滴加溶于无水乙醇的适量质量的GMS，继续加热10 min之后冷却至40 ℃保温2 h，于25 ℃静置2 d，之后在3 000 r·min-1条件下离心10 min，取沉淀物进行冷冻干燥、研磨后过100目筛，所得样品即小麦直链淀粉-单甘酯-色氨酸三元复合物。参照祖岩岩等[16]方法，根据XRD图谱通过软件Jade6.0计算得到三元复合物相对结晶度(relative crystallinity,RC)。XRD仪扫描条件为管压40 kV、管流40 mA、Cu-Kα(λ=0.154 2 nm)射线、步宽0.02°、扫描区域5°～35°。

2.3 三元复合物制备单因素试验

按照方法2.2制备三元复合物，以无水乙醇体积分数35%、色氨酸质量0.11 g、GMS质量0.07 g为固定条件，分别考察无水乙醇体积分数(25%、30%、35%、40%、45%)、色氨酸质量(0.07、0.09、0.11、0.13、0.15 g)、GMS质量(0.03、0.05、0.07、0.09、0.11 g)对三元复合物结晶结构及其结晶度的影响。

2.4 三元复合物制备正交优化试验

在2.3试验结果基础上，以无水乙醇体积分数(30%、35%、40%)(A)；色氨酸质量(0.09、0.11、0.13 g)(B)；GMS质量(0.05、0.07、0.09 g)(C)为因素,用L9(34)正交试验表进行试验。因素水平如表1所示。

表1 正交试验设计Table 1 Design of orthogonal test

2.5 三元复合物性质分析

2.5.1 X-射线衍射测定 以小麦直链淀粉为对照，根据方法2.2取经过正交优化得到的三元复合物进行XRD测定。

2.5.2 傅里叶红外光谱测定 以小麦直链淀粉为对照，参照陈玲等[17]的方法，并稍加修改。将3 mg的经过正交优化得到的三元复合物和0.3 g 溴化钾混合研磨制成圆片，以空气为空白对照，通过傅里叶红外光谱仪，以分辨率4 cm-1扫描64 s，范围为4 000～400 cm-1，得到傅里叶红外光谱(fourier transform infrared spectrometer，FT-IR)图谱。

2.5.3 便携式拉曼光谱测定 以小麦直链淀粉为对照，参照LIU等[18]的方法，通过拉曼光谱仪对经过正交优化得到的三元复合物进行测定。积分时间10 000 ms，激光功率100 W，得到拉曼光谱(Raman)图谱。通过BWIQ 软件对图谱进行分析，找到峰顶拉曼位移在 480 cm-1处的半高峰宽(Full width of half height，FWHH)。

2.5.4 差示扫描量热测定 以小麦直链淀粉为对照，在差示扫描量热仪中铝盘加入3 mg经过正交优化得到的三元复合物，调节至10 mg，25 ℃下密封平衡24 h。温度范围为20～120 ℃，加热速率为10 ℃·min-1，从而得到差示扫描量热(differential scanning calorimetry, DSC)曲线。通过 TA软件分析焓值ΔH和糊化温度，包括起始温度T0、峰值温度Tp和终止温度Tc[19]。

2.5.5 扫描电子显微镜观察 以小麦直链淀粉为对照，参照CHEN等[20]的方法，将经过正交优化得到的三元复合物置于5 Pa压力下镀金120 s。通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)放大5 000 倍观察并成像。

3 结果与分析

3.1 三元复合物制备单因素试验结果

3.1.1 无水乙醇体积分数对三元复合物结晶结构的影响 不同无水乙醇体积分数制备的三元复合物XRD图谱如图1所示。其中，衍射曲线上杂峰很少，显著峰主要有3个，分别在7.53°、13.03°和19.90°处，为V型晶型的特征峰[21]。无水乙醇条件下结晶类型没有发生变化，且结晶结构都比较规整。不同的是RC值随无水乙醇体积分数的增加先增加后降低，对应于衍射曲线中衍射峰峰强度和峰面积先增加后减弱。当无水乙醇体积分数为35%时，复合物的RC值最高为54.8%。

图1 三元复合物在不同无水乙醇体积分数下的XRD图谱Fig.1 XRD patterns of the ternary complexes obtained at different anhydrous ethanol volume fractions

3.1.2 色氨酸质量对三元复合物结晶结构的影响 不同质量的色氨酸制备的三元复合物XRD图谱如图2所示。其中，7.47°、13.01°和19.88°为V型晶型的特征峰，淀粉经复合后为V型结构。衍射峰的面积和强度随色氨酸质量的增加先增加后减弱，对应的RC值也是先增加后降低。当色氨酸0.09 g时，RC值最高为61.4%。

图2 三元复合物在不同色氨酸质量下的XRD图谱Fig.2 XRD patterns of ternary complexes obtained at different tryptophan contents

3.1.3 GMS质量对三元复合物结晶结构的影响 不同质量的GMS制备的三元复合物XRD图谱如图3所示。7.33°、12.87°和19.73°为V型晶型的特征峰，淀粉经复合后为V型结构。RC值从50.8%增加到54.8%再降低到51.4%。对应的衍射峰的面积和强度也先增加后减弱。当GMS质量为0.07 g时，RC值最高为54.8%。

图3 三元复合物在不同GMS质量下的XRD图谱Fig.3 XRD patterns of ternary complexes obtained at different GMS contents

3.1.4 三元复合物制备正交试验结果 正交试验设计结果如表2所示。三元复合物最佳制备工艺是A2B1C2,即无水乙醇体积分数35%，色氨酸质量0.09 g,GMS质量0.07 g，此时三元复合物RC值为61.4%。无水乙醇体积分数对三元复合物制备影响最大，其次是GMS质量，最后是色氨酸质量。

表2 三元复合物制备正交试验设计结果Table 2 Result of orthogonal experimental of ternary complex preparation

3.2 最优三元复合物的性质分析

3.2.1 XRD结果分析 从图4可知，小麦直链淀粉在14.09°、14.81°、16.96°、19.45°、21.98°、23.88°和26.17°有特征峰，为B型结晶结构。而三元复合物主要衍射峰在7.37°、12.87°和19.69°，为V型结晶结构。三元复合物经复合后RC值增加到61.4%，表明小麦直链淀粉与色氨酸、GMS复合后结晶度更高，结构更加长程有序。

图4 小麦直链淀粉和三元复合物的XRD图谱Fig.4 XRD patterns of wheat amylose and ternary complex

3.2.2 FT-IR结果分析 傅里叶红外光谱是用来分析样品成分和结构的仪器，利用红外光谱分析化学键变化推测可能发生的化学变化[22]。同时，淀粉的短程有序性还可以通过红外光谱中1 047 cm-1和1 022 cm-1的吸光度的比值来判断。小麦直链淀粉、三元复合物、色氨酸和GMS的红外光谱如图5所示。三元复合物在 1 730 cm-1和 2 850 cm-1处出现了2种额外的峰，推测在1 730 cm-1是单甘酯的羰基伸缩振动峰[23]，以及色氨酸与小麦直链淀粉形成了酯键。三元复合物和GMS在2 850 cm-1处都有吸收峰，为GMS的亚甲基吸收峰。小麦直链淀粉在3 402 cm-1处出现的宽吸收峰是由淀粉中羟基振动产生的，在2 927 cm-1附近的峰是甲基或亚甲基特征峰。1 647 cm-1附近的峰是羟基弯曲振动产生的，与水的羟基、淀粉的无定形区域有关。1 000～1 300 cm-1的峰归因于酯键的伸缩振动[24]。1 412 cm-1处的峰则是芳环的骨架伸缩振动形成。苯环是属于色氨酸的特征基团，这说明色氨酸存在于复合物中。三元复合物的峰在3 402 cm-1向长波长移动，推测是因为淀粉羟基与色氨酸和淀粉羟基发生结合使羟基减少造成的，以及色氨酸的氨基在3 404 cm-1处有特征峰。三元复合物在1 630 cm-1处有峰，对应于色氨酸的氨基弯曲振动。三元复合物在1 026 cm-1处的吸收峰峰强度比GMS在此处的峰强度大，推测是因为酯键增加造成的，这说明小麦直链淀粉与色氨酸发生酯化反应。因此，小麦直链淀粉、色氨酸、GMS之间发生了化学反应，既不是简单的混合，也不是形成了二元复合物。由表3可知，小麦直链淀粉的红外吸光度的比值高于三元复合物的比值，表明小麦直链淀粉与三元复合物相比，结构更短程有序。

图5 小麦直链淀粉、三元复合物、色氨酸、GMS的

表3 小麦直链淀粉和三元复合物结构的短程有序分析Table 3 Short-range ordered structure of wheat amylose and ternary complex

3.2.3 Raman结果分析 拉曼光谱峰的位置和强度可以反映分子的振动和转动，从而判断分子的化学键。在480 cm-1附近峰顶拉曼位移的FWHH值表征淀粉结构的短程有序程度。FWHH值越低，峰相对强度越强，表明结构更加短程有序[25]。480 cm-1附近峰的半高峰宽是因为该位置显示淀粉的特征峰。从图6中可知，三元复合物在484 cm-1处峰相对强度低于未复合淀粉。由表3可知，三元复合物在484 cm-1附近的FWHH更高，表明三元复合物短程有序性降低。

图6 小麦直链淀粉和三元复合物的拉曼图谱Fig.6 Raman spectra of wheat amylose and ternary complex

3.2.4 DSC结果分析 DSC是通过加热使淀粉样品凝胶化，从而依据淀粉样品的糊化温度和糊化焓判断其样品的稳定性。如图7所示，三元复合物的DSC曲线完全不同于小麦直链淀粉。三元复合物有2个吸热峰，其中，较高的吸热峰正好是淀粉和GMS融化吸热造成的，而宽且低的吸热峰是三元复合物的熔融吸热造成的。如表4所示，三元复合物的糊化温度(T0、TP、TC)升高，推测是因为小麦直链淀粉与色氨酸、GMS复合后，更加长程有序，结构更加稳定，需要更高温才能破坏其结构。三元复合物的ΔH值更低，推测是由于色氨酸是水溶性，抑制水分子进入淀粉颗粒内部，不如小麦直链淀粉凝胶化彻底。

图7 小麦直链淀粉和三元复合物的DSC曲线Fig.7 DSC curves of wheat amylose and ternary complex

表4 小麦直链淀粉和三元复合物的热性质分析Table 4 Thermal analysis of wheat amylose and ternary complex

3.2.5 SEM结果分析 SEM是观察淀粉颗粒的形貌和微观结构直观有效的方法。如图8所示，小麦直链淀粉为粘连的圆球状颗粒，而三元复合物为不规则的圆片及小碎片状颗粒，这说明小麦直链淀粉与色氨酸、单甘酯不是简单混合在一起，经过化学变化使淀粉颗粒形貌完全改变。

注：(a) 5 000倍小麦直链淀粉；(b)5 000倍三元复合物。

4 结论与讨论

以淀粉相关的三元复合物是指将2种不同的配体添加到淀粉中，配体诱导淀粉形成螺旋空腔，随后配体进入空腔与淀粉连接到一起形成的。淀粉、蛋白质和脂类是食物系统的3个主要组成部分，其相互作用对食品的质地和机械性能起着重要的作用。目前，对于三元复合物的研究还比较少，主要集中在不同链长的脂肪酸对淀粉-脂肪酸-乳球蛋白三元复合物方面[8]。链长较短、不饱和度较低的脂肪酸有利于三元复合物的形成，同时β-乳球蛋白有利于促进复合物的形成。本研究对乙醇体积分数、色氨酸质量和GMS质量对三元复合物制备过程中的影响进行了探索，通过正交试验，得到最优制备条件为无水乙醇体积分数35%、色氨酸质量0.09 g、GMS质量0.07 g、小麦直链淀粉质量1.0 g以及结晶温度为40 ℃。对最优三元复合物进行XRD图谱、FT-IR图谱、Raman图谱和DSC图谱性质分析，结果表明三元复合物为V型结晶结构，该结果与淀粉-月桂酸-乳球蛋白三元复合物形成的V型结晶结构相同[26]。小麦直链淀粉与GMS、色氨酸之间不是简单的物理混合，而是发生化学反应复合在一起形成了络合物。与小麦直链淀粉相比，三元复合物结构热稳定性更好，这是由于三元复合物更加长程有序不易凝胶化。研究结果也表明，三元复合物的短程有序性下降是淀粉聚合度降低造成的[24]。

本研究发现，无水乙醇体积分数、色氨酸质量、GMS质量对三元复合物的相对结晶度均有影响, 其中，无水乙醇体积分数影响最大，其次是GMS质量，最后是色氨酸质量。无水乙醇能与水和多种有机溶剂互溶，将不溶于水的GMS和淀粉溶解在一起，并通过影响淀粉沉降速度从而影响淀粉复合物的形成。此外， GMS溶于无水乙醇中，扩大GMS与小麦直链淀粉之间的接触，有利于GMS进入淀粉的螺旋空腔中。当GMS质量太大时，多余的GMS会阻碍复合。虽然色氨酸溶于水，易于与淀粉羟基发生反应，但会受到溶剂无水乙醇的影响。

本研究结果表明，食品添加剂GMS和氨基酸对淀粉结晶结构有影响。谢新华等[27]研究发现，将GMS加入小麦淀粉中，小麦淀粉的结晶结构类型发生改变且形成复合物，复合物的熔融焓小于小麦淀粉的熔融焓，因此冻融稳定性得到提高，这与本研究结果类似。姬广银等[28]研究表明，不同氨基酸简单加入玉米淀粉中，淀粉颗粒形貌、结晶类型均未发生变化，而在本研究三元复合物的形成过程中，氨基酸与淀粉发生了化学反应，淀粉的整体结构受到影响。同时，对于淀粉-蛋白质混合体系来说，淀粉与蛋白质相互作用，可形成复合物，改变结晶类型，增加蛋白质的溶解性，抑制淀粉糊化，改变热特性[29]。同时，与CAI等[25]研究结果相比，本研究制备的三元复合物结晶度更高，结晶结构更加规整、有序，提高食品在高温条件下的稳定性可用于食品的热加工。同时，本研究制备的三元复合物水溶性好，增加了淀粉在食品行业的应用范围。本研究为三元复合物制备更高结晶度和更规整结晶结构打下基础，同时也为面制品多组分之间的相互作用研究提供了参考。