黄淮南部地区小麦品种矮秆基因的分布及其对稀播和密播下农艺性状的影响

裴星旭， 吴文雪， 梁秋芳， 岳超， 张自良， 望俊森， 陈树林， 詹克慧

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450046)

20世纪60年代以来，农作物的矮秆化引发了第一次“绿色革命”， 全世界的小麦产量也得到大幅度提高。目前，小麦矮秆基因已被命名和统一编号的有25个，中国小麦育种应用最广的矮源是来自日本的农林10号(Rht-B1b(Rht1),Rht-D1b(Rht2))和赤小麦(Rht8，Rht9)[1-2]，其中Rht-B1b和Rht-D1b分别被定位在小麦4B和4D染色体上，Rht8被定位在2D染色体上[3]。分子标记的出现和发展促进了遗传连锁图的构建，也为小麦矮秆基因的研究和应用提供了更有效的方法和手段。ELLIS等[4]开发了STS特异性标记BF-MR1,BF-WR1和DF-MR2,DF2-WR2来分别鉴别Rht-B1b和Rht-D1b基因，携带有Rht-B1b(突变型)基因的材料能够用BF-MR1扩增出一条237 bp的目标条带，用BF-WR1无扩增条带，携带有Rht-B1a(野生型，不含Rht-B1b)基因的材料能够用BF-WR1扩增出237 bp的目标片段，用BF-MR1无扩增条带，两者互相验证。同样，含有Rht-D1b(突变型)基因的材料能够用DF-MR2扩增出254 bp的目标片段，用DF2-WR2无扩增条带，含有Rht-D1a(野生型，不含Rht-D1b)基因的材料能够用DF-WR2扩增出264 bp的目标片段，用DF2-MR2无扩增条带。KORZUN等[5]研究发现，SSR标记Xgwm261与Rht8紧密连锁，携带有Rht8基因的材料可以扩增出192 bp的目标条带，可作为Rht8基因检测的分子标记。外源赤霉素(Gibberellic acid 3)也可以用于矮秆基因的检测，能够将矮秆基因分为赤霉素敏感型和不敏感型。贾继增等[1]最早利用赤霉素反应进行鉴定，明确了中国小麦的4个主要矮源，但是赤霉素反应不能有效地区分矮秆基因的等位变异，因此，分子标记检测还是鉴定矮秆基因的有效方法。近年来，上述分子标记方法被广泛用于不同国家、不同地区主要推广应用小麦品种的矮秆基因检测中，并分析了其对主要农艺性状的影响。唐娜等[6]以分子标记和系谱分析相结合，对中国主要麦区的124份小麦品种进行研究，发现携带Rht-D1b有7份，Rht-B1b有22份，Rht8有22份，Rht-B1b和Rht8有34份，Rht-D1b和Rht8有16份，没有检测到同时携带3种矮秆基因的品种；同时，Rht-B1b和Rht-D1b能够降低株高，缩短旗叶长和苗期叶长，Rht-D1b和Rht8能够显著增加穗粒数。王玉叶等[7]采用SSR和STS分子标记检测257份小麦品种，结果显示Rht8分布频率最多，Rht-D1b次之，Rht-B1b最少。大量研究表明，在黄淮麦区中Rht-D1b和Rht8的分布最广，Rht-B1b分布较少[8-11]。张德强等[11]利用黄淮麦区的129份小麦品种的分析结果表明，不同矮秆基因及其组合的株高降低程度由大到小依次是Rht-B1b>Rht-D1b>Rht-B1b+Rht8>Rht-D1b+Rht8>Rht8>无矮秆基因，Rht8能够显著增加穗粒数。矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b能够显著降低株高，并且具有累加效应[12-13]，这2个基因聚合在一起能够有效提升小麦产量[14-15]。目前，小麦矮秆基因分子标记的研究与利用已经取得很大进展，但其对主要农艺性状的影响研究还不够深入，而且结果差异大，特别是农艺性状多在单一环境中稀播单株水平上进行鉴定的，而生产上密播种植，二者的农艺性状有明显差异。本研究利用黄淮南部麦区近些年推广和新育成的198份小麦品种(系)，利用分子标记检测其矮秆基因组成，并设置不同的稀播和密播环境鉴定主要农艺性状的表现，探讨不同矮秆基因组合对主要农艺性状的影响，为小麦高产育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料主要来自黄淮南部地区推广品种、新育成品种和正在参加该区域试验的优良品系及部分骨干亲本和历史品种共计198份，包括河南164份，山东10份，江苏7份，河北5份，陕西5份，北京4份，山西1份，安徽1份和四川1份(中国春)(具体品种(系)名称略)。

1.2 方法

1.2.1 田间试验与农艺性状调查 田间试验分为稀播和密播试验。稀播试验分别种植于河南农业大学郑州科教试验园区(2013—2014,2014—2015和2015—2016)、商丘市农业科学院试验基地(2013—2014)和驻马店市农业科学院试验基地(2013—2014)，4行区，2次重复，行距23 cm，行长1 m，株距6 cm。密播试验分别种植于河南农业大学郑州科教试验园区(2014—2015和2015—2016)、商丘市农业科学院试验基地(2014—2015)和驻马店市农业科学院试验基地(2014—2015)，4行区，2次重复，行距23 cm，行长1.5 m，每行均匀播种110粒种子。田间管理同当地大田。

稀播试验在中间两行中部选择10株，调查其株高和单株穗数及主茎的穗下节长、脖长、旗叶长与宽、旗叶夹角、穗长、可育和不育小穗数等，收获20个主茎穗测定穗粒数、千粒质量和单株粒质量，抽穗期和开花期为全小区50%的主茎穗抽出穗或开花(以4月1日为1计时间)。密播试验在中间2行中部随机选择10穗，调查其穗下节长、脖长、旗叶长与宽、旗叶夹角、穗长、可育和不育小穗数等，在小区中部测量5个株高数值，调查中间2行的穗数折算单位面积穗数，随机收获20个穗测定穗粒数、千粒质量和单株粒质量，抽穗期和开花期为全小区50%的麦穗抽出穗或开花。

1.2.2 矮秆基因的分子标记检测 在小麦苗期取植株幼嫩叶片，采用CTAB法提取小麦全基因组总DNA，加ddH2O 100 μL后放4 ℃冰箱溶解6～12 h使其充分溶解，用紫外分光光度计检测DNA浓度，-20 ℃放置保存。用于扩增Rht-B1b和Rht-D1b基因的引物参考ELLIS等[3]设计的BF-MR1/BF-WR1和DF-MR2/DF2-WR2，Rht8基因扩增引物参考KORZUN等[4]报道的SSR引物Xgwm261(表1)。所用引物均由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为10 μL，样本DNA 1 μL，2×Taq MasterMix 4.5 μL，ddH2O 3.5 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，63 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，拍照。

表1 检测小麦矮秆基因所用的分子标记Table 1 Molecular markers used to detect dwarfing genes

1.2.3 数据整理和统计分析 利用Excel分稀播和密播对农艺性状数据进行整理和特征数计算及相关分析，采用SPSS软件进行方差分析，多重比较采用Duncan的新复极差法。

2 结果与分析

2.1 黄淮南部地区小麦品种矮秆基因的分布

2.1.1 黄淮南部地区小麦品种矮秆基因的标记检测 携带Rht-B1a基因的材料能够用BF-WR1扩增出一条237 bp的条带，用BF-MR1无扩增条带，携带Rht-B1b基因的材料可以用BF-MR1扩增出一条237 bp的条带，用BF-WR1无扩增条带，两者互补验证(图1A和图1B)。携带Rht-D1a基因的材料能够用DF-WR2扩增出一条264 bp的目标片段，用DF2-MR2无扩增条带，携带Rht-D1b基因的材料能够用DF-MR2扩增出254 bp的目标片段，用DF2-WR2无扩增条带，两者互补验证(图1C和图1D)。携带Rht8基因的材料可以用Xgwm261扩增出一条192 bp的条带(图1E)。

M:DNA marker；1：矮抗58；2：郑麦9023；3：豫农186；4：周8425B；5：百农207；6：周麦18；7：小偃22；8：西农979；9：偃展4110；10：豫麦18；11：西农529；12：中国春。

根据对198份材料的检测结果，有24份材料携带Rht-B1b，占供试材料的12.12%，代表品种有周8425B、小偃22、西农529等；携带Rht-D1b的材料较多，有160份，占80.81%，代表品种有矮抗58、郑麦9023、豫农186等；携带Rht8基因的材料较多，有159份，占80.3%，代表品种有矮抗58、豫麦18、百农207等。说明黄淮南部地区主要利用的小麦矮秆基因是Rht-D1b和Rht8。

2.1.2 黄淮南部地区小麦品种矮秆基因组合的分布频率 198份材料中共检测出7种不同矮秆基因组合(表2)，没有发现携带有3个矮秆基因的材料，不携带这3个矮秆基因的材料有4份，占2.02%。有26,12和7份材料分别只携带矮秆基因Rht-D1b,Rht-B1b和Rht8，分布频率分别为13.13%,6.06%和3.54%，有132,15和2份材料分别携带2个矮秆基因组合Rht-D1b+Rht8,Rht-B1b+Rht8和Rht-B1b+Rht-D1b，分布频率分别为66.67%,7.58%和1.01%，说明黄淮南部地区小麦矮秆基因的组成主要是Rht-D1b+Rht8。

表2 198份材料矮秆基因组合的分布Table 2 Distribution of dwarfing gene composition in 198 assayed varieties

2.2 不同矮秆基因组合对农艺性状的影响

表3 不同农艺性状的遗传力及环境间的相关系数Table 3 The heritability and correlation coefficients between environments for agronomic traits

从小麦茎秆性状与其他农艺性状的相关分析结果(表4)看出，性状间的相关系数在稀播和密播之间相差很小，表现出较好的一致性，但不同的性状间相关系数差异较大,茎秆性状之间均呈极显著的正相关性，相关系数均在0.6以上，其与旗叶长和旗叶夹角呈极显著的正相关性，相关系数多在0.4以上，3个茎秆性状中只有株高与旗叶宽呈极显著的负相关，穗下节长和脖长与其无相关性，说明茎秆性状与旗叶性状关系较密切。茎秆性状与生育期、穗部性状和产量性状的相关性尽管有些也达到了显著或极显著水平，但相关系数均在0.3以下，相关程度很低。

表4 小麦茎秆性状与其他农艺性状间的相关系数Table 4 Correlation coefficients between stem and other agronomic traits

2.2.2 不同矮秆基因组合对小麦茎秆性状的影响 从不同矮秆基因组合对3个茎秆性状的影响(表5)可以看出，无论在稀播还是密播条件下，7种矮秆基因组合对株高、穗下节长和脖长的效应均达到极显著水平，携带矮秆基因材料的表型平均数与不携带的差异均达到极显著水平。平均株高和穗下节长的大小次序均为None>Rht8>Rht-B1b>Rht-D1b>Rht-B1b+Rht8>Rht-D1b+Rht8>Rht-B1b+Rht-D1b，平均脖长的大小次序为None>Rht8>Rht-D1b>Rht-B1b>Rht-B1b+Rht8>Rht-D1b+Rht8>Rht-B1b+Rht-D1b。其差异只是携带单基因Rht-B1b和Rht-D1b次序不一样，但二者在2种种植密度下3个性状的平均数间均不存在显著差异，说明不同矮秆基因组合对株高及其相关性状的影响是一致的，而且不同种植密度之间也是相同的。

表5 不同矮秆基因组合对小麦茎秆性状的影响Table 5 The contents of polyphenols from Wan’ai

双矮秆基因的降秆作用均高于单基因的，多数差异达到显著水平，说明矮秆基因具有累加效应。与不携带矮秆基因的材料相比，携带单基因Rht-D1b材料的稀播和密播株高分别降低40.48和34.27 cm，降低幅度分别34.18%和28.46%；携带单基因Rht-B1b的材料的稀播和密播株高分别降低37.87和31.91 cm，降低幅度分别31.98%和26.50%；携带单基因Rht8材料的稀播和密播株高分别降低35.67和30.52 cm，降低幅度分别30.12%和25.34%。单基因稀播条件下降低株高均在35 cm以上，密播条件下降低株高均在30 cm以上。与不携带矮秆基因的材料相比，携带双基因Rht-B1b+Rht-D1b材料(无Rht8)的稀播和密播株高分别降低46.86和42.93 cm，降低幅度分别39.57%和35.65%；携带双基因Rht-B1b+Rht8材料(无Rht-D1b)的稀播和密播株高分别降低44.78和37.68 cm，降低幅度分别37.81%和31.29%；携带双基因Rht-D1b+Rht8(无Rht-B1b)材料的稀播和密播株高分别降低45.44和39.27 cm，降低幅度分别38.37%和32.61%。双基因稀播条件下株高降低在45 cm左右，密播条件下株高降低在40 cm左右。稀播的株高降低幅度普遍大于密播的，穗下节长和脖长的结果也类似。无论是单基因还是双基因，降秆作用最大的是Rht-D1b，Rht-B1b次之，二者没有显著差异，Rht8的作用最小，与Rht-D1b的差异达到显著水平。

2.2.3 不同矮秆基因组合对小麦其他农艺性状的影响 矮秆基因不仅能够起到降秆作用，对其他农艺性状也有一定的影响。不同矮秆基因组合对其他12个农艺性状的方差分析表明，无论是稀播还是密播，7种矮秆基因组合对抽穗期、开花期、旗叶长、旗叶宽、旗叶夹角、可育小穗数、不育小穗数、穗长、穗数、千粒质量和单株粒质量的效应均达到极显著水平，但是对于穗粒数，只有稀播的达到极显著水平，密播的没有显著差异，故不再对其进行效应分析。

从不同矮秆基因组合对抽穗期和开花期的影响(表6)可以看出，不同组合对抽穗期和开花期的影响不一致。不同矮秆基因组合的稀播和密播平均抽穗期表现基本一致。携带矮秆基因的抽穗较早，单基因Rht8对抽穗期影响最大，提早抽穗2 d左右，其次是Rht-B1b，提早抽穗1.5 d左右，影响最小的是Rht-D1b，与无矮秆基因的差异不显著。不同矮秆基因组合的稀播和密播平均开花期表现基本一致，携带单基因Rht-D1b材料的开花期比无携带矮秆基因的较晚。这与抽穗期的表现相反。其他携带矮秆基因材料的开花较早，单基因Rht8对开花期影响最大，其次是Rht-B1b，均与无矮秆基因的差异达到显著水平。比较单基因和双基因的抽穗期和开花期，基因之间均没有累加效应。无论是抽穗期还是开花期，矮秆基因对稀播的影响幅度要大于密播的。

表6 不同矮秆基因组合对小麦不同生育时期的影响Table 6 Effects of different dwarfing gene combinations on wheat growth period

从不同矮秆基因组合对3个旗叶性状的影响(表7)可以看出，与不携带矮秆基因的材料相比，携带的材料表现出旗叶变短、变宽以及夹角变小，而且变化幅度较大，其中，旗叶长减少范围为4.27～7.72 cm，旗叶宽增加范围为0.20～0.51 cm，旗叶夹角减少范围为33.06 °～72.27 °。同一性状的不同基因组合在稀播和密播条件下的表现基本一致，但稀播的影响幅度要大于密播的。单基因Rht-D1b对旗叶长影响最大，其次是Rht8，Rht-B1b影响最小，三者之间差异多达到显著或极显著水平。单基因Rht8对旗叶宽影响最大，Rht-B1b和Rht-D1b影响较小，二者没有显著差异。单基因Rht-D1b对旗叶夹角影响最大，其次是Rht-B1b，Rht8影响最小，三者之间差异均达到极显著水平。比较单基因和双基因旗叶性状的差异，基因之间均没有累加效应。

表7 不同矮秆基因组合对小麦旗叶性状的影响Table 7 Effects of different dwarfing gene combinations on flag leaf traits

表8为不同矮秆基因组合对3个穗部性状的影响。从表8结果可以看出，同一性状的不同基因组合在稀播和密播条件下的表现基本一致。携带单基因和不携带矮秆基因材料的可育小穗数间差异较小，均没有达到显著水平，它们均低于携带双基因材料的，但只有部分差异达到显著水平。携带矮秆基因的不育小穗数均极显著多于不携带矮秆基因的，但6种矮秆基因组合间差异较小，基本没有达到显著水平。携带Rht-B1b+Rht-D1b基因组合的穗长极显著长于其他组合类型的，但该组合只有2个材料，代表性不强，其他类型的穗长差异不大。

表8 不同矮秆基因组合对小麦穗部性状的影响Table 8 Effects of different dwarfing gene combinations on spike traits

从不同矮秆基因组合对产量性状的影响(表9)可以看出，矮秆基因组合的作用因性状和种植密度而异。无矮秆基因的稀播单株穗数最多，但其密播单位面积穗数最少，二者与其他基因组合的差异多达到显著或极显著水平，除Rht-B1b+Rht-D1b的稀播单株穗数和密播单位面积穗数明显较少外，其他携带矮秆基因组合间的差异不大。不同基因组合在稀播和密播条件下的千粒质量高低次序完全一致，携带矮秆基因材料均高于不携带的，除Rht-B1b+Rht8密播不显著外，其他差异均达到显著水平，且千粒质量高出3.87～8.63 g，效应最大的是Rht8，其次是Rht-B1b，最小的是Rht-D1b，但相互之间差异较小，矮秆基因Rht-B1b与Rht-D1b及Rht-D1b与Rht8具有累加效应。不同基因组合在稀播和密播条件下的单穗粒质量高低次序基本一致，携带矮秆基因材料均高于不携带的，多数差异达到显著或极显著水平，效应最大的是Rht-B1b，其次是Rht-D1b，最小的是Rht8，但相互之间差异较小，矮秆基因Rht-B1b与Rht-D1b以及Rht-D1b与Rht8具有累加效应。

表9 不同矮秆基因组合对小麦产量性状的影响Table 9 Effects of different dwarfing gene combinations on yield traits

3 结论与讨论

矮秆基因在全世界范围内得到了广泛研究和应用，不仅有效降低了株高，提高了小麦抗倒伏能力和抗旱能力，还提升了小麦品种的产量水平。随着研究的深入，尽管不断有新的矮秆基因被定位和克隆[16-17]，但是由于一些矮秆基因与农艺性状的不利连锁，被用于广泛利用的只有Rht-B1b,Rht-D1b和Rht8等少数基因[1-2,13]。中国利用较广泛的矮秆基因也是这3个基因，但不同麦区基因分布频率有差异[9,18-19]，黄淮麦区主要以Rht8和Rht-D1b较多，Rht-B1b较少，分布频率一般在30%以下[10-11,19]。本研究通过对黄淮南部地区198份小麦品种进行检测，发现携带Rht-D1b和Rht8品种的分布频率分别为80.81%和80.30%，携带Rht-D1b+Rht8基因的品种多达66.67%，而携带Rht-B1b的品种较少，只有12.12%。这与朱浩等[20]研究结果较一致，说明目前黄淮南部地区利用的矮秆基因更集中于Rht-D1b和Rht8。究其原因，可能与该区的品种多为“周麦”系列品种的血缘有关，其代表品种豫麦21、周麦13、周麦16、周麦18、周麦22、周麦26、周麦27等都携带Rht-D1b和Rht8，没有Rht-B1b。

大量研究表明，Rht-D1b的降秆作用最强，Rht-B1b次之，Rht8最小，基因之间存在累加效应[6,11-13,21]。这些研究结果在本试验中得到进一步证实。为了提高农艺性状鉴定的准确性，本试验采用5个稀播环境和4个密播环境进行了表型鉴定，矮秆基因的降秆作用在2种密度环境的结果较一致。无论是单基因还是双基因，降秆作用最大的是Rht-D1b，Rht-B1b次之，二者没有显著差异，Rht8的作用最小，与Rht-D1b的差异达到显著水平，基因之间存在明显的累加效应。基因组合降秆作用大小为None>Rht8>Rht-B1b>Rht-D1b>Rht-B1b+Rht8>Rht-D1b+Rht8>Rht-B1b+Rht-D1b。不同稀播的降秆作用普遍大于密播的，稀播条件下单基因降低株高均在35 cm以上，密播条件下均在30 cm以上，稀播条件下双基因降低株高在45 cm左右，密播条件下降低株高在40 cm左右。黄淮南部地区小麦适宜株高一般不超过80 cm，从密播的株高结果看，携带单矮秆基因材料的株高达不到要求，必须同时携带2个矮秆基因。此外，矮秆基因还缩短了穗下节长和脖长，有利于株型结构的改良，不同基因的作用大小与株高基本一致。

矮秆基因对小麦其他性状也有影响。唐娜等[6]研究表明，Rht-B1b和Rht-D1b缩短了旗叶长度，Rht-D1b和Rht8显著增加穗粒数，3个矮秆基因对小穗数没有显著影响。张德强等[11]研究认为，Rht-B1b和Rht-D1b和对产量相关性状没有影响，Rht8能够提高千粒质量和显著增加穗粒数。朱浩等[20]研究认为，矮秆基因对有效分蘖、穗长、小穗数和穗粒数等没有显著差异，对有效分蘖还有一定的负效应，Rht8可以显著提高千粒质量，而Rht-B1b和Rht-D1b对千粒质量也存在一定的负效应。JOBSON等[22]研究发现，矮秆基因Rht-B1b会降低开花期旗叶光合速率、子粒蛋白质和粒质量。本研究表明，除可育小穗数、穗长和穗粒数外，矮秆基因对其他性状的影响较大，携带矮秆基因能够使抽穗提前、旗叶长度缩短、旗叶宽度增加、旗叶夹角大幅度变小、不育小穗数增加、单位面积穗数增加、千粒质量提高和单穗质量增加。矮秆基因对农艺性状影响的研究结果差异较大，这可能与农艺性状易受环境影响有关。KUCHEL等[23]研究发现，矮秆基因对生态环境敏感，在不同的环境条件下对于性状的影响也不一样。本试验所研究的15个性状中只有茎秆性状和生育时期受环境影响较小，其他性状影响较大。除密播的穗数和千粒质量明显高于稀播，其他性状的稀播遗传力高于密播，而且大多数性状稀播下矮秆基因的影响幅度普遍大于密播下的。由于大多数研究是在单一环境进行稀播的表型鉴定，因此表型鉴定的方法及准确性和不同生态区的差异应是结果不一致的主要原因。此外，从本试验茎秆性状与其他农艺性状的关系看，矮秆基因起到了降秆和优化旗叶性状的作用，有助于构建合理的株型结构，但对其他性状的改进，应该不是基因的直接作用，可能为适应株型结构的改变进行人为选择的结果。总之，矮秆基因的应用改良了黄淮麦区小麦品种的农艺性状，应该是产量潜力提升的主要原因。