基于JNK/c-Jun信号通路探讨孟鲁司特钠抑制小鼠腹主动脉瘤形成的机制

雍熙 王贤芝 张富钊 陈镜全 郑江华 陈开

(1川北医学院附属医院，四川 南充 637000；2广元市第一人民医院)

腹主动脉瘤(AAA)是一种常见的主动脉退行性疾病〔1〕，男性患者居多，主要是由于吸烟、高血压、动脉硬化等因素导致主动脉膨胀隆起，目前AAA的发病率也逐年升高。虽然各种治疗手段不断改进，但其发病率仍居高不下，AAA造成的血管破裂，致死率较高，抢救成功率较低〔1〕。AAA是以炎症浸润与氧化还原系统紊乱为主要的特征性病变，发病时炎症因子过度表达导致局部炎症细胞浸润，浸润的炎症细胞作用于氧化系统，造成氧化应激，促进AAA的启动与形成〔2〕。以c-Jun为靶向蛋白的c-Jun氨基端激酶(JNK)，是哺乳类动物细胞内广泛存在的信号通路〔3〕。研究证实〔4〕JNK信号通路可被细胞应激刺激和肿瘤坏死因子(TNF)-α激活，激活的JNK通路通过磷酸化或者细胞骨架相关蛋白因子或者调控相关蛋白酶及底物的表达，参与热休克、氧化损伤等多种生物刺激反应，在人类多种疾病的发生与发展中起着关键的调控作用。孟鲁司特钠是一种治疗支气管哮喘的药物，除了抗炎之外，同时具有抗氧化、改善血脂、改善血管内皮功能的作用〔5,6〕。研究表明〔7,8〕孟鲁司特钠可以有效抑制巨噬细胞聚集，减轻血管壁炎症反应。本研究采用旨在探讨孟鲁司特钠通过JNK/c-Jun信号通路对AAA小鼠的保护作用。

1 材料和方法

1.1试验动物及主要试剂 8～10周雄性SPF级ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：〔SCXK(京)2011-0011〕；血管紧张素(Ang)Ⅱ(批号：SGA103 )、硼替佐米(批号：SE103 )采购自Sigma公司；孟鲁司特钠杭州默沙东制药有限公司(批号：DISN230382)；TUNEL试剂盒(批号：SA625)购自博士德生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(批号：2017030928)，化学发光试剂盒(批号：2017110812)购自广东锐博生物科技技术股份有限公司；兔抗大鼠p-JNK(批号：PE210612)、p-c-Jun(批号：BE284321)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)(批号：OE948589)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2(批号：SE398034)兔抗GAPDH(批号：C503028)及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批号：20170212)采购自美国abcam公司；小鼠白细胞介素(IL)-1(批号：AP1062)、IL-4(批号：A1209300)、IL-6(批号：A1805603)、IL-10(批号：E289180)检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；总胆固醇(批号：D29183874)、三酰甘油(批号：A294772884)、高密度脂蛋白(批号：M8782974)、低密度脂蛋白(批号：S20998313)试剂盒购自尚柏生物医学技术有限公司。万濠VTM-4030光学显微镜，上海长岛生物技术有限公司AVDIA2400自动凝胶成像系统，佳能KS25数码相机。

1.2模型构建和分组处理 实验前大鼠适应性饲喂7 d，随机分为四组，假手术组、模型组、阳性组、实验组各30只，实验前禁食24 h，以20 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，腹部除毛常规消毒，剪开腹部皮肤通过皮下埋植AngⅡ缓释泵，AngⅡ以1 000 ng/(min·kg)灌注构建动物AAA模型，缝合皮肤，小鼠苏醒后送入鼠房，假手术组开腹后直接缝合皮肤，不做埋植缓释泵处理。阳性组和实验组每天分别给予50 mg/kg硼替佐米和孟鲁司特钠，以2 ml生理盐水配成悬液灌胃，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，连续用药4 w。

1.3小鼠血脂含量变化情况检测 给药4 w后空腹尾部采血利用总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量试剂盒检测各指标变化，操作过程严格按照试剂盒的说明进行。

1.4腹主动脉直径测定及AAA发生率计算 将小鼠麻醉，固定于手术台上，剪断颈动脉取血。剥离游离肾动脉至髂动脉之间的腹主动脉，从主动脉根部分叉离断整个主动脉及主动脉的颈动脉分支。 置于手术台上，观察主动脉形态，数码相机拍照，游标卡尺测量肾上腹主动脉最大外径。

1.5苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠腹主动脉内壁组织的病理学改变 取新鲜血管，生理盐水洗涤，10%中性缓冲甲酸液固定12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、铜质模具包埋，连续切片4 μm的组织切片，二甲苯浸泡10 min脱蜡、梯度酒精浸泡，自来水冲洗30 min，经HE染色，65℃ 2 h，生理盐水冲洗，盐酸酒精分化、磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、伊红染色，梯度酒精脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.6小鼠血清内炎症因子的检测 小鼠处死前，尾部静脉采血2 ml，4℃、3 000 r/min离心5 min，取上层血清，利用试剂盒检测IL-1、IL-4、IL-6、IL-10的含量，操作过程严格按照试剂盒的说明进行。

1.7TUNEL染色检测大鼠主动脉细胞凋亡 将主动脉组织石蜡切片，3%H2O2浸洗三次，PBS洗涤3次，加入0.01 1-间苯磺酸钠基-5-硫基-1H-四氮唑(MTBS)，加入蛋白酶K溶液工作液在30℃室温水解15 min，PBS洗涤3次，加入含2%过氧化氢的PBS，反应10 min，PBS洗涤；然后加入TUNEL反应混合液，加封口膜在暗湿盒中反应60 min，温度37℃，PBS漂洗，加50 μl的conberter-POD，加封口膜在暗湿盒中反应1 h，温度37℃，PBS漂洗，然后加入DAB 20℃反应15 min，PBS漂洗，苏木素复染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察，凋亡阳性细胞呈棕黄色，在光学显微镜下计数，5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞数量占总细胞数量为细胞凋亡阳性指数(AI)。

1.8Western印迹检测p-JNK、p-c-Jun、Bax和Bcl-2蛋白的表达 取出-20℃冰冻主动脉组织200 g，超声匀浆充分裂解组织，将混合物置于低温离心机12 000 r/min离心，取上清即为蛋白溶液。加入100 μl蛋白质于96孔板中，37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，滤纸吸干，加入相应一抗，37℃孵育20 min，PBS洗涤，加入酶标二抗，37℃10 min，加入底物显色，终止液终止反应，酶标仪在450 nm处测吸光值。BCA定量法检测蛋白浓度，待测样品和上样缓冲液混合，100℃水域变性5 min，然后加入至制备好的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶(5%浓缩胶，10%分离胶)上样孔中，每孔25 μl，浓缩胶时调整电压为60 V，分离胶电压为120 V，结束后取出凝胶，4℃转膜1.5 h，采用5%脱脂奶粉封闭聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入一抗，4℃过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL显影，采用自动凝胶成像系统采集图像，以GAPDH作为内参，分析蛋白水平。

1.9统计学分析 采用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组小鼠血浆内TC、TG、LDL、HDL含量 与假手术组相比，模型组TC、TG、LDL明显升高，HDL含量明显降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性组和实验组的TC、TG、LDL明显下降，HDL含量明显升高(P<0.05)；阳性组和实验组相比，TC、TG、LDL、HDL含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组血浆内TC、TG、LDL、HDL含量比较

2.2各组小鼠腹主动脉直径测定及AAA发生率 手术剥离小鼠腹主动脉，模型组腹主动脉表面有明显的隆起，阳性组、实验组动脉壁有隆起但较模型组轻，假手术组未见明显隆起(图1)。与假手术组相比，模型组腹主动脉直径及AAA发生率明显升高(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、实验组腹主动脉直径及AAA发生率明显降低(P<0.05)；阳性组和实验组相比，腹主动脉直径及AAA发生率差异不显著(P>0.05)，见表2。

表2 各组腹主动脉直径测定及AAA发生率比较

图1 AAA小鼠腹主动脉解剖

2.3各组小鼠腹主动脉组织病理变化 模型组小鼠主动脉壁增厚、多见内膜斑块、外膜增厚、内膜多见出血点且有炎症浸出；假手术组动脉壁细胞排列整齐、细胞结构清晰，未见急性出血点和斑块，管壁较薄；阳性组和实验组小鼠管壁可见较少的胶原沉积，管壁细胞完整的且排列有序，外膜明显比模型组薄且少见炎症反应，见图2。

图2 孟鲁司特钠对AngⅡ诱导AAA小鼠腹主动脉组织病理变化的影响(HE)

2.4各组小鼠血清内炎症因子含量 模型组IL-1、IL-4、IL-6、IL-10显著高于假手术组(P<0.05)，阳性组、实验组IL-1、IL-4、IL-6、IL-10显著低于模型组(P<0.05)；阳性组、实验组相比，差异不显著(P>0.05)，见表3。

表3 各组血清内IL-1、IL-4、IL-6、IL-10含量比较

2.5各组小鼠腹主动脉壁细胞凋亡 TUNEL染色凋亡阳性细胞细胞核呈棕黄色。与假手术组〔(12.62±1.49)%〕相比，模型组〔(81.06±1.55)%〕明显升高，阳性组〔(33.46±2.06)%〕、实验组〔(34.54±2.03)%〕与模型组相比均明显下降(P<0.05),见图3；模型组的Bcl-2/Bax(0.48±0.04)显著低于假手术组(2.68±0.11,P<0.05)，阳性组(1.61±0.12)、实验组Bcl-2/Bax(1.68±0.08)显著高于模型组(P<0.05)，见图4。

图3 各组小鼠腹主动脉壁细胞凋亡(TUNEL，×400)

图4 Western印迹检测各组Bax、Bcl-2蛋白表达

2.6各组小鼠腹主动脉壁细胞p-JNK、p-c-Jun表达 与假手术组相比，模型组小鼠腹主动脉壁细胞p-JNK、p-c-Jun显明显升高(P<0.05)，与模型组相比，阳性组和实验组小鼠腹主动脉壁细胞p-JNK、p-c-Jun表达明显降低(P<0.05)，见表4、图5。

表4 各组腹主动脉壁细胞 p-JNK、p-c-Jun蛋白相对表达量

图5 各组腹主动脉壁细胞p-JNK、p-c-Jun表达

3 讨 论

AAA是由于主动脉壁增生变厚、弹性减弱、纤维及胶原蛋白丧从而导致腹主动脉形态及功能变化的心血管疾病。目前随着老龄化、高血压、高血脂人群的增多，该疾病愈演愈烈〔9〕，调查显示〔10〕，AAA的发病率为5%～10%，一旦破裂死亡率超过70%，主动脉瘤目前治疗主要依靠人工切除及血管置换腹主动脉手术进行，但对于直径小于5.5 cm的瘤体，治疗效果不佳〔11〕，对于此类患者，采用控制血流动力学或降低血管脂质含量来控制瘤体发展，研究表明通过药物控制血脂含量可明显延缓瘤体的生长〔12〕。本研究表明孟鲁司特钠可以抑制血管内脂肪物质的沉淀，延缓瘤体的发生发展。

AAA是以动脉壁的异常降解，动脉粥样硬化及脂质浸润为主要的病理特征〔13〕，严重危害人们身体健康的一种疾病，文献报道〔14〕称AAA最先出现炎性浸润，随着病情的发展弹力纤维降解，血管机械强度降低，最终引起不可逆的主动脉壁局限性瘤体，本研究结果提示孟鲁司特钠能够降低血管瘤的发生率。

文献报道〔15〕称，炎症反应介导的细胞凋亡在AAA的发生发展中起重要作用，是AAA发生重要因素，因此减少炎症反应可以有效减少AAA的发病率。既往研究结果〔16〕显示孟鲁司特钠可以明显抑制AAA模型细胞凋亡。Bax作为促凋亡基因，主要通过与线粒体结合，促进其释放促凋亡蛋白诱导凋亡，而Bcl-2则会阻止Bax与线粒体结合，从而抑制细胞凋亡〔17〕。本研究结果提示孟鲁司特钠能够抑制血管壁细胞凋亡。

研究表明〔18〕JNK/c-Jun信号通路对调节细胞生长、蛋白合成、细胞代谢至关重要，该通路的活化与细胞炎症反应密切相关。JNK/c-Jun信号通路活化是通过磷酸化JNK的T172位点，激活的JNK直接作用于c-Jun，加重炎症反应从而诱导细胞凋亡〔19,20〕。本研究结果提示JNK/c-Jun信号通路参与了AAA的发生发展，孟鲁司特钠治疗后，p-JNK、p-c-Jun水平明显降低，说明孟鲁司特钠可能是通过抑制JNK/c-Jun信号通路保护AAA小鼠血管功能。

综上，孟鲁司特钠可以保护血管紧张素Ⅱ诱导的ApoE 基因敲除小鼠AAA的形成，其机制可能是通过抑制血管脂肪沉积及抑制JNK/c-Jun信号通路降低炎性反应来完成。