PCB118诱发大鼠胰岛素抵抗及对骨骼肌细胞功能的影响

汤金梅 吕荣 毕亭亭 凌玲 徐晓 黄祺 乔慧瑛 杨绪枫

(苏州市第九人民医院老年医学科，江苏 苏州 215200)

糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足或者胰岛素不能正常发挥生理功能的内分泌代谢紊乱疾病，是继肿瘤、心血管疾病之后第三大威胁人类健康的慢性疾病，是一个在全国乃至全世界均严峻的公共卫生问题〔1〕。糖尿病目前发病原因仍不甚清楚，目前认为遗传因素、环境因素是其主要病因，特别是环境因素起着越来越重要的作用〔2〕。环境内分泌干扰物(EEDs)是一种能对生物或人的生殖、发育、免疫系统功能起重要影响的化学物质，多氯联苯(PCBs)是EEDs的一种，其生物活性极其稳定，并具有亲脂性，能够蓄积于肝脏、肾脏、肺等器官的脂肪组织中，并通过食物链逐级的富集，对人群健康产生重要影响〔3〕。目前有研究表明暴露于低水平的PCB中能够增加胰岛素抵抗及2型糖尿病的患病风险〔4〕。PCB118在PCB中最具代表性，能够评估环境中总的PCB，本课题组前期研究证实低剂量的PCB118暴露降低了大鼠胰岛素敏感性，本课题组将进一步探讨其具体机制。

1 材料与方法

1.1动物 40只清洁级体重(200±20)g的健康雄性Wistar大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。大鼠在SPF级，(20±2)℃动物房饲养，5只/笼，自由饮水、摄食。

1.2主要试剂与仪器 PCB118标准品购于美国AccuStandard公司；葡萄糖试剂盒购于北京中生北控生物科技股份有限公司；糖化血红蛋白试剂盒购于南京建成生物技术有限公司；胰岛素免疫吸附试剂盒购于美国R&D公司；反转录试剂盒(第一链cDNA合成试剂盒)购于大连宝生生物技术有限公司；肌醇激酶(IRE)1α、磷酸化(p)-IRE1α、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2、p-JNK1/2、胰岛素受体底物(IRS-1)、p-IRS-1、葡萄糖转运蛋白(GLUT)-4及GAPDH购于美国Abcam公司。Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度计购于美国Thermo公司；Multiskan FC酶标仪购于Thermo Fisher公司。

1.3动物模型的建立〔5〕将大鼠随机分为正常对照组，低、中、高剂量组，每组大鼠10只。低、中、高剂量组大鼠每组分别腹腔注射10、100、1 000 μg/(kg·d)的PCB118(PCB118溶解于玉米油溶液中)，正常对照组大鼠腹腔注射等体积的玉米油，每周给药5 d，连续13 w。

1.4样品的制备及相关指标的检测 大鼠末次给药禁食5 h后，尾静脉采血，加入蛋白沉淀剂，离心获得上清液，根据试剂盒说明书测定大鼠空腹血糖(FBG)含量。HbA1c的测定方法：通过购自深圳普门科技公司的GH-900Plus全自动型糖化血红蛋白检测分析仪及配套的试剂进行测定，严格遵照说明书的步骤进行操作。将大鼠麻醉，腹主动脉采血于抗凝管，3 000 r/min离心15 min取上清液，根据试剂盒说明书采用空腹血清胰岛素(FINs)测定FINs水平。计算胰岛素敏感指数(ISI)，ISI=ln〔1/(FBG×FINs)〕。根据HOMA模型计算胰岛素抵抗指数(IRI)，IRI=(FINs×FBG)/22.5。同时将麻醉后的大鼠后肢内侧皮肤剪开，使股四头肌暴露出来，顺着股骨方向用眼科剪将肌肉组织剪下来，并保存于-80℃冰箱备测。

1.5Realtime-PCR法检测骨骼肌组织IRE1-α、JNK1/2、IRS-1及GLUT-4 mRNA的表达 根据Trizol试剂盒说明书提取骨骼肌组织中总RNA，DEPC水溶解RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度，当检测出的RNA纯度(OD260 nm/OD280 nm=1.8)良好时候，根据反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，反应条件：30℃ 6 min，40℃ 20 min。最后进行Realtime PCR分析，预变性95℃，15 min；变性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40个循环。用2-△△Ct法分析mRNA表达量。

1.6Western印迹检测细胞中IRE1α/JNK/IRS-1信号通路相关蛋白的表达 将骨骼肌组织匀浆并加入含有蛋白酶抑制剂及PMSF的细胞裂解液裂解30 min，4℃离心，收集上清液。BCA试剂盒检测蛋白浓度，上样，进行12%十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，转聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的BSA室温下孵育1 h，兔抗IRE1α、p-IRE1α、JNK1/2、p-JNK1/2、IRS-1、p-IRS-1、GLUT-4多克隆抗体溶液4℃过夜孵育，第2天室温孵育二抗，最后根据化学发光免疫试剂盒说明书在凝胶成像系统中曝光各蛋白条带，并分析条带灰度值。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1PCB118对大鼠FBG、FINs及HbA1c的影响 与正常对照组比较，低、中、高剂量组FBG、FINs及HbA1c均显著提高(P<0.01)。见表1。

表1 PCB118对大鼠FNG、FINs及HbA1c的影响

2.2PCB118对大鼠IRI、ISI的影响 与正常对照组比较，低、中、高剂量组ISI减低、IRI提高(P<0.01)。见表2。

表2 PCB118对IRI、ISI的影响

2.3PCB118对大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信号通路mRNA表达量的影响 与正常对照组比较，低、中、高剂量组IRE1α、JNK1/2、IRS-1 mRNA表达量上调(P<0.01)，GLUT-4 mRNA表达量下调(P<0.01)。见表3。

表3 PCB118对大鼠骨骼肌中IRE1-α/JNK/IRS-1信号通路mRNA表达量的影响

2.4PCB118对大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信号通路蛋白表达量的影响 与正常对照组比较，低、中、高剂量组p-IRE1α、p-JNK1/2、p-IRS-1表达量上调(P<0.01)，GLUT-4蛋白表达量下调(P<0.01)。见图1、表4。

1～4：正常对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组图1 PCB118对大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信号通路蛋白表达量的影响

表4 PCB118对大鼠骨骼肌中IRE1α/JNK/IRS-1信号通路蛋白表达量的影响

3 讨 论

2型糖尿病在我国糖尿病人群中约占90%，胰岛素缺乏或者抵抗是2型糖尿病的重要发病机制〔6〕。胰岛素抵抗主要是指胰岛素的靶器官及外周组织对胰岛素敏感性降低，致使胰岛素所产生的生物学效应降低，而机体为了维持内环境稳定，代偿性地促进胰岛素分泌，所导致的高胰岛素血症。其中长期的高血糖将使机体的糖、脂肪、蛋白质代谢异常，产生有毒物质，因此FBG是反映糖尿病严重程度及恢复程度的直接指标。HbA1c在一定时间内与血糖浓度呈相关关系，能反映机体的血糖水平。FINs最重要的功能是调节机体血糖水平，能使机体血糖浓度不管是餐后还是饥饿状态均处于一定范围内。因此一定程度上的调控2型糖尿病患者糖代谢及胰岛素敏感性对于疾病的预防及治疗具有重要作用。

PCB118是PCBs中最持久的一种同系物，是评估环境中总PCBs的直接指标。PCB118普遍存在于我国长江三角洲的水、土壤、水生生物及泥样中，也存在于江苏南部的土壤样本中，同时在人体的组织及母乳中也发现一定的含量。在市售禽类食品中，PCB118也是PCBs中含量最大的单体。而且研究还表明PCB118的暴露对于人体生殖系统、皮肤功能、免疫系统及行为改变具有显著的影响。在3T3-L1脂肪细胞中，PCB118和PCB138(非二噁英PCB)能显著促进脂肪细胞分化，并增加脂质滴的大小。腹腔注射给予C57BL/6小鼠PCB118或PCB138，也能显著增加脂肪质量和脂肪细胞大小。同时两种PCB在体内外都能显著诱导胰岛素抵抗，抗糖尿病药物二甲双胍能减轻PCB诱导的胰岛素抵抗〔7〕。且本课题组前期研究证实低剂量的PCB118暴露降低了大鼠胰岛素敏感性〔8〕，所以本研究在前期研究基础上进一步探讨PCB118对大鼠胰岛素抵抗的作用，结果表明PCB118显著提高大鼠FBG、FINs、HbA1c含量及IRI，减低ISI，进而说明PCB118能诱发大鼠胰岛素抵抗。

骨骼肌、肝脏、脂肪是胰岛素抵抗发生的主要靶器官，人体80%葡萄糖的摄取和消耗均是通过骨骼肌实现的，因此骨骼肌作为胰岛素抵抗的主要靶器官在糖尿病的发生发展过程中起着重要作用〔9〕。在生理条件下，胰岛素与骨骼肌细胞上的胰岛素受体结合，使IRS-1磷酸化，进而激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，并引发后续一系列蛋白质磷酸化级联反应，促使GLUT-4移位到细胞膜上，葡萄糖从细胞外转运到细胞内，最终完成胰岛素刺激的骨骼肌细胞葡萄糖的摄取。在整个过程中主要涉及IRS-1被激活后所引起的生物学反应。研究显示PCB代谢产物会导致蛋白质的错误折叠，内质网是真核细胞中蛋白质折叠、翻译、合成的重要场所，因此对细胞的应激反应起着重要调节作用。内质网应激(ERS)与肝脏、肌肉的胰岛素抵抗密切相关。研究显示ERS发生后，能够迅速激活IRE1α，进而激活JNK信号通路，被激活的JNK信号通路能够通过一系列激酶反应使IRS1发生磷酸化，阻断胰岛素信号传导，抑制胰岛素生物学效应，使胰岛素抵抗发生。IRE1是存在于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，由两个亚型，分别为IRE1α、IRE1β。其中IRE1β紧存在于肠上皮细胞，而IRE1α能够广泛存在于各种细胞中，并具有激酶和内切酶活性，在ERS主导的细胞应激反应中起着重要作用。JNK是一种丝裂原蛋白酶激酶家族的主要成员之一，由三个亚型，分别为JNK1、2、3。JNK1、2能够广泛存在于人体各种细胞中，而JNK3则只表达于睾丸、心脏、脑组织中。被活化后的JNK能够激活IRS1在丝氨酸307位点发生磷酸化，并减弱胰岛素的敏感性。研究显示胰岛素能够通过激活IRE1-α刺激X盒结合蛋白1(Xbp1s)生成，Xbp1s进一步提高IRS-1及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平，进而增加了过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)γ活性、GLUT4在细胞表面的易位及脂肪细胞中葡萄糖的摄取〔10〕。有研究也表明短期暴露于PCB118，能提高小鼠循环三酰甘油水平，同时也观察不到炎症因子的变化，但在肝脏组织及脂肪组织中发现脂素基因(LIPIN)1和GLUT4表达的下调〔5，11〕。因此本研究进一步探讨PCB118对IRE1α/JNK/IRS-1信号通路相关蛋白表达量的影响，结果表明PCB118能显著上调大鼠骨骼肌中IRE1α、JNK1/2、IRS-1表达，下调GLUT-4表达，进而诱发大鼠胰岛素抵抗。