白花前胡乙素通过SREBP1c/FASN信号通路抑制卵巢癌SK-OV-3细胞增殖的作用

薛乃铭 柴梦钰 杨万山 周宪春

(延边大学医学院 1临床医学专业，吉林 延吉 133002；2病理生理学教研室；3延边大学附属医院肿瘤科)

卵巢癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，对女性生命造成严重威胁〔1,2〕。由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，卵巢癌早期难以发现〔3,4〕，其病死率在妇科肿瘤中居首位。现阶段暂无防治卵巢癌有效的治疗方式与治疗药物。白花前胡乙素是从白花前胡根中提取的一种角型吡喃香豆素成分，具有降气化痰，散风清热的作用〔5～7〕。近年研究表明，白花前胡乙素是胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1c的抑制剂，能够通过调节脂代谢发挥降血脂、预防心血管疾病及抗肿瘤作用〔8〕。脂代谢在肿瘤细胞的能量存储、细胞增殖及重要信号分子合成等方面起到重要作用。调节肿瘤细胞物质能量代谢成为预防和治疗肿瘤的新途径〔9,10〕。Ahmed等〔11〕研究表明卵巢癌患者SREBP1c高表达，提示抑制SREBP1c调节卵巢癌细胞脂代谢过程，为防治卵巢癌提供了新思路。目前关于白花前胡乙素防治卵巢癌的作用研究报道较少，对于其发挥药效的作用机制研究较少，本实验研究白花前胡乙素对卵巢癌细胞增殖的抑制效果。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人卵巢癌细胞SK-OV-3株来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

1.1.2药品与试剂 白花前胡乙素购自成都格利普生物科技有限公司，其纯度在98%以上；胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、青-链霉素等实验原料均购自美国Gibco公司；CCK-8购自日本同仁化学研究所；c-Myc、G1/S-特异性周期蛋白(Cyclin)D1、SREBP1c、脂肪酸合成酶(FASN)mRNA、β-actin上下游引物、探针等均由InvitrogenTM公司负责设计合成；从DBI公司选购荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂；SREBP1c (Ab28481)兔单克隆抗体购自美国Abcam公司；FASN兔单克隆抗体、β-actin 兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG二抗均购自美国CST公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、ECL超敏化学发光液、细胞蛋白提取试剂、RNA提取试剂均购自美国Thermo Fisher Scientifu公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶快速制备试剂盒购自美国EpiZyme Scientifu公司；超纯水，剩余试剂均使用实验室常用规格试剂。

1.1.3实验仪器 CO2培养箱、xMark酶标仪、电泳仪、全能蛋白转膜仪、TC20细胞计数器、PCR实时定量仪均购自美国伯乐公司；TDL-50B离心机购自上海安亭科学仪器厂；分析天平(FB1035)购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；G:BOX化学成像分析系统购自英国Syngene公司；CKX31倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；Vortex Mixer涡旋仪、hh-s24恒温水浴锅均购自太创始华利达实验设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1培养细胞 由10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素共同组成DMEM高糖培养基，用于培养卵巢癌细胞，培养箱条件为恒温37℃、CO2浓度5%，同时对细胞的生长情况进行观测与记录。

1.2.2药物配置 配置白花前胡乙素溶液：选取白花前胡乙素对照品42.6 mg，另选取二甲基亚砜(DMSO)10 ml，将白花前胡乙素对照品溶于DMSO，由此配置获得浓度为100 mol/L的白花前胡乙素对照品母液，储存温度为-20℃。需使用时，可以结合实际使用需求抽取白花前胡乙素对照品母液随后稀释至10 mol/L，最后将稀释后的溶液通过0.22 μm微孔滤膜便可使用。

1.2.3白花前胡乙素浓度筛选 提取适量处于生长期的细胞，在胰酶消化的作用下形成细胞悬液同时用细胞计数器进行计数，5 000个/孔，每孔体积100 μl，铺于96孔板。设有空白组、对照组、浓度不同的药物组，每组配备复孔数量为6个。药物组需要依次通过浓度为10、20、40、60、80、100 mol/L的培养基进行培养，空白组与对照组的培养基体积相同。48 h后，在每个孔中加入10 μl CCK-8试剂，后续培养2 h。用酶标仪450 nm波长处测定吸光度(A)对细胞存活率进行计算。重复上述步骤3次，最终获得可靠结论。细胞存活率(%) =(A药物组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.2.4分组及给药 取对数生长期卵巢癌细胞SK-OV-3，接种于100 mm培养皿中，设对照组和白花前胡乙素给药组(20、40、60 μmol/L)，不同剂量的白花前胡乙素给药作用24 h后，收集细胞用于检测分析，重复实验3次。

1.2.5白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中迁移的影响 10 μl枪头在每孔单层细胞上迅速轻柔地划痕，洗去悬浮细胞，然后给予不同浓度白花前胡乙素作用24 h后观察各组细胞划痕修复率。

1.2.6白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA表达水平的影响 不同浓度白花前胡乙素在药物作用下对细胞进行收集。在RNA提取试剂盒的作用下对卵巢癌细胞SK-OV-3中的RNA进行提取，在逆转录酶的作用下实现RNA逆转录为cDNA，随即运用RT-qPCR对c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA的实际表达效果进行检测。当反应体系为10 μl的情况下，PCR扩增条件为：①温度为95℃时预变性为2 min；②在95℃条件下变性10 s，62℃温度条件下退火时间30 s；③72℃温度条件下延伸时长15 s，循环共计40个，β-actin作为内参，通过2-△△Ct法计算对相关基因mRNA的相对表达量进行表示，表1所示为引物序列。

表1 引物序列

1.2.7白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中SREBP1c/FASN信号通路相关蛋白表达的影响 浓度不同的白花前胡乙素作用下对细胞进行收集，在蛋白提取剂的作用下对蛋白实现有效提取，使用BCA试剂盒对蛋白含量进行有效测定。提取蛋白样品含量40 μg，在SDS-PAGE电泳分离作用下转至0.45 μm的PVDF膜上，将蛋白含量为5%脱脂牛奶进行封闭1 h，随后使比例为1∶1 000的SREBP1c、FASN等一抗在摇床孵育过夜，温度为4℃。清洗TBST3次，每次清洗时长为10 min，1∶10 000的二抗在室温条件下孵育1 h，重复上述清洗操作，当ECL显色后，在G:BOX成像分析系统的作用下获得条带，β-actin作为内参，在Image J图像软件的作用下分析灰度值。

1.3统计学方法 使用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1筛选白花前胡乙素给药浓度 不同浓度白花前胡乙素对卵巢癌细胞SK-OV-3增殖均有抑制作用，且随浓度升高和作用时间延长抑制作用增强，结合实际筛选结果，最终选定白花前胡乙素溶液浓度为20、40、60 μmol/L，在卵巢癌细胞SK-OV-3的毒性浓度作用并不明显，24 h后可以作为白花前胡乙素的给药条件。见表2。

表2 不同浓度的白花前胡乙素做用不同时间对SK-OV-3细胞存活率的影响

2.2白花前胡乙素对SK-OV-3细胞迁移的影响 与对照组〔(83.65±4.11)%〕比较，20、40、60 μmol/L白花前胡乙素给药后，卵巢癌细胞SK-OV-3的划痕修复率〔(41.15±3.05)%、(38.75±2.85)%、(19.68±2.02)%〕均显著降低(P<0.05)，表明白花前胡乙素能够抑制卵巢癌细胞SK-OV-3迁移。见图1。

图1 划痕实验检测不同浓度白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中迁移的影响(×400)

2.3白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA表达水平的影响 与对照组比较，20、40、60 μmol/L白花前胡乙素组SK-OV-3细胞中c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA表达均显著降低(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 白花前胡乙素在c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA的表达水平

2.4白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中SREBP1c/FASN信号通路相关蛋白表达的影响 SK-OV-3细胞在20、40、60 μmol/L白花前胡乙素给药作用24 h后，与对照组比较，SREBP1c、FASN蛋白表达均显著降低(P<0.05,P<0.01)。见图2、表4。

1～4：对照组、白花前胡乙素20 μmol/L组、白花前胡乙素40 μmol/L组、白花前胡乙60 μmol/L组图2 白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中SREBP1c/FASN信号通路蛋白表达的影响

表4 白花前胡乙素对SK-OV-3细胞中SREBP1c/FASN信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

卵巢癌具有极高的死亡率〔12〕。由于卵巢癌在发生发展过程中，其病理类型繁多，发病前期不易察觉，扩散快，缺乏有效的早期筛查及诊断方法，因此卵巢癌作为女性生殖器恶性肿瘤疾病，对广大女性朋友的生命健康安全构成严重威胁。虽然现阶段尚不清楚卵巢癌的发病机制，但可以得知其与妊娠、激素、避孕、遗传及生活饮食习惯等因素相关〔13〕。目前临床上对于卵巢癌治疗主要以切除为主，但易复发，给患者带来巨大痛苦，因此探寻有效防治卵巢癌的药物具有重要意义。研究表明，高脂饮食引发的能量代谢紊乱是诱导卵巢癌发生的高危因素〔14〕。肿瘤发生发展与恶性转化是一个多因素参与、多阶段进行的动态过程。肿瘤细胞代谢重编程是调控肿瘤发生发展过程中的重要因素，可以使得肿瘤细胞在不利的生存环境下保持选择性的生长优势。肿瘤细胞代谢重编程涉及糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代谢、脂代谢和核酸代谢等诸多方面。其中，脂代谢在肿瘤细胞的能量存储、细胞增殖及重要信号分子合成等方面起重要作用。脂代谢紊乱是肿瘤的主要特征之一。SREBP1c与FASN在肿瘤细胞物质能量代谢过程中发挥着重要作用〔15〕。SREBP1c是脂质代谢的关键调控因子，能够调控FASN，从而促进肿瘤细胞内脂质合成。FASN是乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成长链脂肪酸的关键酶，有研究报道，FASN是一个癌基因，与肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生发展有关〔16〕。研究表明，白花前胡乙素是从中药植物白花前胡根中提取得到的一种香豆素类化合物，是SREBP1c的选择性抑制剂。本研究结果表明，不同浓度的白花前胡乙素对卵巢癌细胞SK-OV-3增殖及迁移具有抑制作用，同时白花前胡乙素能够抑制SREBP1c、FASN的表达，抑制卵巢癌能量代谢，从而抑制c-Myc、CyclinD1等增殖相关基因的表达，发挥抑制卵巢癌细胞增殖的作用。