CCD联合色谱法优化燥湿洗剂的提取工艺△

陈晓双，宋毅，费小凡

四川大学 华西医院 临床药学部，四川 成都 610041

燥湿洗剂为中药复方制剂，主要成分包括威灵仙、马齿苋、黄芩、大黄、黄柏等13味中药，具有清热燥湿、杀虫止痒的功效[1-3]。近年来，燥湿洗剂在临床上常应用于渗出性皮炎的治疗，效果良好。

目前，国内未见关于燥湿洗剂以提高主要活性成分为目的的工艺及质量标准研究的报道。黄芩苷为黄芩的主要活性成分，将黄芩苷作为该制剂的指标性成分，其在黄芩中的质量分数高达10.11%[4]。黄芩苷具有清热、抗炎、杀菌等药理作用[5-7]。本研究以黄芩苷作为指标成分，采用线性回归的Plackett-Burman (PB)设计和Central Composite设计[8-12]，分析主要影响因素间的交互作用，并联合液相色谱法对其成分测定进行方法学考察，优化处方提取工艺，提升质量标准，以建立全面的燥湿洗剂提取工艺方法，提高其治疗疗效，为进一步研究开发该处方提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-10AVP型高效液相色谱系统(日本岛津公司)；ME203E型电子天平[梅特勒-托利多(Mettler-Toledo)仪器有限公司]；旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)；SHZ(Ⅲ)型真空水泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；AS3120型超声清洗机(天津AutoScience仪器有限公司)。

1.2 试药

黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-200815，纯度>99%)；乙醇、三氯甲烷、磷酸均为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)；甲醇为色谱纯(美国Sigma-Aldrich贸易有限公司)；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含量测定方法学考察

2.1.1对照品溶液制备 精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇使其质量浓度为60 μg·mL-1，即对照品溶液。

2.1.2供试品溶液影响因素单因素考察

2.1.2.1提取方法考察 精密量取3份燥湿洗液(上清液)各2 mL，置于50 mL圆底烧瓶中，加70%乙醇40 mL，分别采取加热回流提取1 h、超声处理1 h和浸泡过夜3种方式进行提取，滤过，滤液置于50 mL量瓶中，用70%乙醇多次清洗滤纸和滤渣，并入50 mL量瓶中，定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜进行滤过，得供试品溶液。结果见图1A。提取方法为加热回流时，黄芩苷的含量最高。

注：A.不同提取方法；B.不同加热提取时间；C.不同提取溶剂比例。图1 不同提取方法、加热提取时间及提取溶剂对供试品中黄芩苷含量的影响

2.1.2.2加热时间考察 分别采用1、2、3 h作为加热时间进行提取，其他操作同2.1.2.1。结果见图1B。加热提取时间为1 h时，黄芩苷的含量最高。

2.1.2.3提取溶剂考察 分别采用50%、70%、95%乙醇各40 mL进行提取，其他操作同2.1.2.1。结果见图1C。提取溶剂为70%乙醇时，黄芩苷的含量最高。

2.1.2.4供试品溶液制备 精密量取燥湿洗剂2 mL，加入70%乙醇40 mL，加热，冷凝回流提取1 h，滤过，滤液置于50 mL量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液。

2.1.3色谱条件 色谱柱为Amethyst C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.2%磷酸(47∶53)；流速：1 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：(280±4) nm；进样量：10 μL。

2.1.4线性关系考察 配制质量浓度分别为21.66、54.15、108.30、216.60、433.20、866.40 μg·mL-1黄芩苷对照品。采用液相色谱方法，进样量均为10 μL，测定峰面积值。以峰面积值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，黄芩苷回归方程为Y=4 703.1X+5 738.7，r=0.999 9。结果表明，质量浓度为0.022～0.866 mg·mL-1，黄芩苷的峰面积值与对照品进样含量呈良好的线性关系。

2.1.5精密度试验 精密吸取2.1.1项下黄芩苷对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积值，其RSD=0.53%，表明精密度良好。

2.1.6稳定性试验 取供试品分别于0、2、4、6、8、10 h时进样10 μL，测定峰面积，其RSD=0.78%，表明该供试品溶液在10 h内黄芩苷含量变化不大，说明10 h内该样品保持稳定。

2.1.7重复性试验 精密量取同一燥湿洗剂样品，按供试品配制方法进行制备，制得5份供试品样品。精密吸取供试品溶液及上述对照品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪中，按2.1.3色谱条件连续进样，分别测定黄芩苷含量，并计算其RSD=1.11%，表明该方法的重复性良好。

2.1.8加样回收率试验 分别精密量取已测定含量的供试品6份，每份1 mL，分别置6个圆底瓶中，精密加入质量浓度为0.405 mg·mL-1黄芩苷对照品溶液1.0 mL，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪中，测定黄芩苷含量，RSD=1.83%。表明本方法具有良好的回收率。

2.2 PB设计优化提取工艺

通过PB试验筛选燥湿洗剂工艺中的最显著影响因素，通过引入粉碎粒度(A)、浸泡时间(B)、料液比(C)、提取次数(D)、提取时间(E)5个影响因素，根据前期单因素筛选出的各因素水平范围，按照高效液相色谱法(HPLC)对不同组别中黄芩苷含量进行平行测定，综合考察这5个因素对燥湿洗剂中黄芩苷含量的影响。选用n=12的PB设计，每个因素取高(+)、低(-)2个水平。PB设计中，为了方差分析和估计试验误差，一般可增加1～3个虚拟变量，为保证误差估计的可信度，该设计表中增加了F、G、H 3个空白因素。利用Design Expert试验设计软件，设计PB试验，并对其结果进行分析(表1)。

表1 PB设计筛选燥湿洗剂的不同影响因素和水平

设计分组及结果见表2，因素效应分析评价见表3。表2所示，12次试验中，A～E的5个因素高(+)、低(-)水平分别出现了6次，当某个因子处于高水平时，其余因子各出现高、低水平各3次，通过计算这个因素在高、低水平时试验响应的均值并求两均值之差就可得到此因素的效应，其中F～H空项效应的均方和为标准差估计值。空项效应对应的标准差值均较小，说明该试验产生的随机误差较小。表3中模型的P值为0.005 4，P<0.05，说明该模型具有显著性。表3中F值的大小表明，料液比>提取次数>提取时间，故对黄芩苷含量影响最大的3个因素分别是料液比、提取次数和提取时间。选取这3个因素进行后续CCD试验。

表2 PB设计筛选燥湿洗剂不同影响因素的结果

表3 PB设计筛选燥湿洗剂不同影响因素的方差分析结果

2.3 响应面法优化提取工艺试验

综合PB试验和单因素影响试验结果，筛选出影响最显著的3个因子，即料液比(X1)、提取时间(X2)和提取次数(X3)，利用Design-Expert 8.0.5b软件进行CCD响应面设计，采用3因素3水平，中心点重复6次，共运行试验20次，试验设计与结果见表4～5，方差分析结果见表6。

表4 响应面设计燥湿洗剂中显著影响因素及水平

表5 燥湿洗剂中显著影响因素的响应面设计及其黄芩苷含量

表6 燥湿洗剂中显著影响因素的响应面结果及方差分析结果

将因变量与另外两因素拟合为三维立体作用图和预测图，结果见图2。响应面曲面图是对各因素与两两因素的交互作用的最直观的反应，提取时间对燥湿洗剂黄芩苷含量影响最大，其次为料液比，提取次数影响最小。提取时间与料液比的交互作用对燥湿洗剂提取效果影响最大，其次为提取次数与料液比的交互作用，提取时间与提取次数的交互作用最不显著。

图2 提取时间、提取次数、料液比对燥湿洗剂提取效果的响应面三维效应面图

根据Design-Expert 8.0.5b软件优化燥湿洗剂最佳提取工艺条件为提取时间60 min、提取数2次、料液比1∶10。

2.4 验证实验

根据Design Expert 8.05b软件优化出最佳提取工艺：粉碎粒度为细碎，浸泡时间为60 min，料液比为1∶10，提取时间为60 min，提取数为2次。为了检验结果的可靠性，精密平行称定5份按上述优化工艺进行实验，测定黄芩中黄芩苷质量浓度分别1.156 8、1.229 4、1.165 4、1.186 8、1.179 7 mg·mL-1，平均质量浓度为1.183 6 mg·mL-1，与响应面法预测值1.204 2 mg·mL-1的相对误差为1.70%，说明验证值与回归方程预测值吻合较好，优化后的燥湿洗剂提取工艺对进一步生产具有一定的指导意义。

3 讨论

在影响燥湿洗剂提取工艺的各因素中，为筛选多因素对黄芩苷主要药效成分表达量的影响，前期通过单因素试验，对药材粉碎粒度、浸泡时间、料液比、提取时间和提取次数进行初步筛选。结果显示，以燥湿洗剂中黄芩苷含量为指标，不同影响因素的最佳表达水平：粉碎粒度为细碎(1～6 mm)、浸泡时间为60 min、料液比为1∶10、提取1 h、共提取2次。进而在初步筛选的范围基础上，通过PB试验，同时对多个因素进行交互作用分析，根据F值大小，筛选具有显著性的关键因素，结果显示，影响燥湿洗剂中黄芩苷含量最主要的3个影响因素为料液比、提取时间和提取次数。将这3个主要影响因素进行响应面分析，通过CCD试验，观察各影响因素间的交互作用及燥湿洗剂提取工艺中的最佳工艺和表达量。分析结果表明，燥湿洗剂最优提取工艺为料液比为1∶10，提取时间为60 min，提取次数为2次，每100 mL燥湿洗剂中黄芩苷的量最高，提取效果最好，优于单因素优化结果。在燥湿洗剂提取工艺优化过程中，采用PB设计、响应面设计方法，比传统的正交试验更为精确和快捷，通过求解线性回归方程模型，可以预测出最佳的工艺条件，具有精度高、模型预测好的优点。

综合单因素试验、PB试验和响应面试验结果，得到燥湿洗剂的最佳提取工艺：以水为提取剂，粉碎粒度为细碎，提取前浸泡60 min，料液比为1∶10，提取1 h，共提取2次，燥湿洗剂中黄芩苷质量浓度可达1.183 6 mg·mL-1。综合分析单因素试验、PB试验及CCD试验结果，采用该方法能够对燥湿洗剂提取工艺进行优化，并提高有效成分的含量，该方法能够为燥湿洗剂的综合开发利用提供参考。