不同品种桑叶单宁和凝集素含量的检测及评价

黄添就 闭海龙 陈芳艳 林碧敏 何镜新 刘武林 陈金联 钟杨生 林健荣

（1.阳山县兴达蚕业有限公司 广东清远 513100；2.华南农业大学动物科学学院 广东广州 510642；3.华南农业大学基础实验与实践训练中心 广东广州 510642）

植物中的单宁和凝集素是饲料中的主要抗营养因子。单宁是一种具有较强生物学特性和药理活性的多酚类物质，会抑制肠道微生物的生长，阻止其对钙、铁等离子的吸收，影响畜禽的正常发育[1]。当畜禽日粮中单宁含量过高时，会影响畜禽对营养物质的利用，导致其代谢紊乱，降低畜禽对饲料的吸收率和进食量。凝集素是一种非免疫原性、与糖专一结合，并能凝集细胞和（或）沉淀含糖高分子的蛋白质或糖蛋白。凝集素会降低肠道内某些酶的活性，改变肠道微生物环境，从而影响营养物质的吸收。大量的植物凝集素进入血液循环系统会导致动物体重下降，甚至中毒死亡。另外，植物凝集素对免疫球蛋白有抑制作用[2]。

我国桑树资源丰富，适种范围广，桑叶的营养成分全面而且丰富。为了拓宽其用途，充分、全面提高桑叶的利用价值，相关研究人员近年来对桑叶在畜禽饲料中的添加量做了大量研究。王亚男等（2019）在育肥猪饲粮中添加6%的发酵桑叶能有效提高猪的日增重、降低料重比，提高其生长性能，并且能提高其肌肉中不饱和脂肪酸和氨基酸含量[3]。饲料中添加2%桑叶粉时可增加扬州鹅胸肌厚度，加入4%时开始下降；添加6%和8%的桑叶粉则会显著降低平均日增重，增加料重比[4]。对蛋鸡的研究表明，只有低含量的桑叶粉（添加3%）能够显著提高蛋鸡产蛋率[5]。王永昌（2016）研究了桑叶粉对清远鹅生长性能、屠宰性能、器官发育等指标的影响，发现桑叶粉添加量≥3%时，对肉鹅生长不利[6]。张英（2019）对獭兔的研究表明，饲料桑在獭兔日粮中替代比例为6%[7]。这些研究结果均显示，桑叶或桑叶粉在畜禽饲料中的添加量高时，其应用效果则不理想。一些研究认为是桑叶中含有的抗营养因子所致，因此，有必要筛选抗营养因子含量低的桑树品种。

目前，对桑叶中单宁及凝集素的研究大多集中在其提取方法和活性功能检测方面，对桑树不同品种及叶位中单宁和凝集素含量的研究报道较少[8-9]。本研究检测不同品种和叶位中桑叶单宁和凝聚素的含量，以期为桑叶在畜禽饲料领域的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

桑叶采摘于华南农业大学教学桑园基地，包括桐乡青、伦109、梧桐桑、抗青10、睦州青、沙2×109、红顶桑、甜桑、伦教40、粤桑11、荷叶白11个品种，采集叶位为从上往下数第5 叶位至第10 叶位之间，获得11 个桑叶样品。选择桑41、桑19、化稀这3 个品种，采集上叶位（从顶端往下数第1 片到第5 片）、中间叶位（桑树中间位置取5 片叶）和下叶位（从底端往上数第1 片至第5 片）的叶片，获得3 个品种上、中、下叶位共9 个样品。

1.1.2 试剂

钨酸钠、磷钼酸、磷酸、碳酸钠、单宁酸、95%乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠、凝集素等均为市售分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 桑叶粉的制备

新鲜桑叶用自来水清洗干净表面，去除泥沙等杂物后，再用蒸馏水洗净，甩干水分，置于恒温烘箱中60 ℃干燥，然后用植物粉碎机粉碎，过40目筛，得到桑叶粉样品，做记录后置于冰箱中保存备用。

1.2.2 桑叶单宁的提取

参见丁晓雯等（2013）的方法提取单宁[10]。取桑叶粉样品1 g，加入浓度为65%乙醇25 mL，在65 ℃恒温水浴15 min后，超声破碎提取15 min，提取完成后过滤，收集滤液。余下的残渣再加入浓度为65%的乙醇25 mL提取，方法同第一次。反复提取3 次后，合并3 次滤液，并用浓度为65%的乙醇定容至100 mL。每个品种样品重复3 次。

1.2.3 单宁含量的测定方法

参见钟雨珅等（2015）的方法测定[8]，简述如下。

首先制作标准曲线，准确称取单宁酸0.010 0 g，用纯水溶解并定容至100 mL，得到浓度为0.10 mg/mL的标准溶液。分别准确吸取单宁酸标准溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加Folir-Denis试剂（钨酸钠10 g，磷钼酸2.5 g，用70 mL的蒸馏水溶解后，再加5 mL的磷酸，混匀后放置沸水浴回流2.5 h，待冷却后用蒸馏水定容至100 mL）2.5 mL及饱和碳酸钠溶液5 mL，加水稀释至刻度并充分混合，静置30 min后，以试剂空白调零，在750 nm波长处测其吸光度。以单宁浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度值A750nm为纵坐标绘制标准曲线并作回归方程，得到的回归方程为Y=0.057 8X+0.005 7，回归系数为R²=0.998 5。取桑叶单宁提取液0.2 mL提取待测样品中的单宁，并根据标准曲线计算出各品种桑叶的单宁含量。

1.2.4 凝集素的提取

参照孙东等（2008）的方法提取凝集素[11]。取桑叶粉2 g，加入40 mL浓度为0.01 mol/L、pH7.2的磷酸缓冲溶液（PBS，内含0.15 mol/L NaCl），在常温（25 ℃）下水浴摇床浸提16 h，得到的浸提液在4 000 r/min离心10 min，取上清液得到桑叶凝集素提取液。

1.2.5 凝集素含量的测定方法

参照戴大章等（2002）的方法测定凝集素含量[12]。首先，取植物血球凝集素PHA-P 20 mg溶于20 mL浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS中，制成浓度1 mg/mL的凝集素标准溶液。

然后，红细胞悬液制备。用注射器在采血管中加入1 mL阿氏液（制备方法：将葡萄糖4.10 g、柠檬酸钠1.6 g、柠檬酸0.11 g、氯化钠0.84 g溶于200 mL蒸馏水中，配制完成后灭菌，置于4 ℃左右保存），从兔耳朵采血2 mL～3 mL，轻轻倒转两次与阿氏液混匀，然后3 000 r/min条件下离心5 min，弃上清液，在沉淀中再加入适量浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS轻轻打匀。同样条件离心，反复两次。弃上清后用沉淀的血块制作成实验中所需要的浓度为2.5%的血细胞悬液。方法是用胶头滴管取血块，并加入0.8%的生理盐水，1∶32比例制成2.5%的红细胞悬液。

最后，凝集素检测。在V型凝血板中每孔先加20 μL浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS，然后在第一列中，取凝集素标准品20 μL，加入第一孔，充分混匀后取20 μL加入第二孔，以此类推往后加。第二列为空白组，取浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS 20 μL，加入第一孔，充分混匀后取20 μL加入第二孔，以此类推往后加。第三列往后的待测样品的加样与凝集素标准品的相同。最后在每个孔中都加入20 μL 2.5%红细胞悬液，混匀后，放室温静置1.5 h～2 h，观察凝集现象。将观察到的现象分为5个不同的级别，分别用0、1、2、3、4来表示。根据凝集效价的比较和已知标准品的浓度计算出被测样品中凝集素的含量，公式如下。

C（mg/g）=S0×F×V÷f0÷W

式中：S0表示标准样的浓度（mg/L）；F表示待测样品溶液的凝集效价；V表示待测样品的体积（mL）；f0表示标准样品溶液的凝集效价；W表示待测样品的质量（g）。

1.2.6 数据处理与统计分析

试验所得数据用Excel软件进行处理，用SPSS22.0和Design-Expert.V8.0.6.1软件对结果（平均数±标准误）进行单因素方差分析以及LSD检验和Duncan检验。显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同品种桑叶单宁和凝集素含量的比较

测定睦州青、沙2×109等11个品种桑叶中单宁和凝集素含量，结果见表1。单宁含量在18.79 mg/g～28.46 mg/g之间，含量最高的桑品种与最低的桑品种之间相差1.51倍。单宁含量最高的是睦州青，最低的是甜桑。单宁含量最低的3 个品种分别为荷叶白、伦教40、甜桑，含量最多的3个品种分别是睦州青、沙2×109、梧桐桑，利用SPSS22.0软件对各品种单宁含量进行显著性分析（α=0.05），大多数品种间单宁含量差异显著，只有梧桐桑和抗青10，粤桑11和桐乡青，以及红顶桑、伦109和荷叶白之间的含量接近，差异不显著。

表1 11 个桑品种单宁和凝集素含量的比较

11 个品种桑叶中凝集素含量在0.13 mg/g～2.11 mg/g之间，最高的是沙2×109，最低的是红顶桑，最高和最低品种间相差16.23 倍。其中，凝集素含量最少的3 个桑品种分别是红顶桑、伦教40和睦州青，3 个品种之间含量差异不显著。凝集素含量最高的3 个桑品种分别为沙2×109、甜桑和桐乡青，甜桑和桐乡青2 个品种间差异不显著，沙2×109显著高于其他品种。11 个品种中有9 个品种均能达到推荐的凝集素在大鼠饲料中的安全限量标准（低于1.25 mg/g）[12]，仅有沙2×109和甜桑2 个桑品种超过此标准。

2.2 不同叶位桑叶单宁和凝集素含量的比较

测定桑41、桑19和化稀3 个桑品种上、中、下叶位单宁和凝集素含量，结果见表2。3 个桑品种的上叶位的单宁和凝集素含量都是最低的，其次是中叶位，最后是下叶位。3 个桑品种的上、中、下叶位单宁含量存在显著差异。桑41的不同叶位间凝集素含量差异不显著，桑19的上叶位与中叶位凝集素含量差异不显著，化稀的不同叶位凝集素含量差异显著。

表2 3个品种上、中、下叶位的单宁和凝集素含量

3 讨论

植物饲料中单宁的质量浓度在0.5 mg/g～349 mg/g之间。当单宁浓度高于60 mg/g时，被认为是饲料的抗营养因子；当单宁浓度低时，反而有益无害。例如，动物体内的单宁含量在5 mg/g～55 mg/g时，可以降低蛋白质的瘤胃降解率而提高氮的利用率，同时抑制反刍动物膨胀病和寄生虫病的发生；单宁含量20 mg/g～40 mg/g时，可以提高动物的平均排卵率、体重、毛产率和产奶率[13]。本研究测定的11 个桑品种单宁含量分布在18.79 mg/g～28.46 mg/g之间，与常规的植物饲料相比，这11个桑品种的单宁含量均不高，对畜禽的生长不会造成不良的影响。

凝集素普遍存在于植物中，以豆科植物研究得最多，豆类籽中凝集素含量为10 mg/g～30 mg/g[12]。本研究测定的11 个桑品种凝集素含量在0.13 mg/g～2.11 mg/g之间，远远低于豆类中的含量。目前，饲料行业对凝集素并无明确的限量标准，但研究表明，凝集素对动物的生长与代谢会产生影响。当植物凝集素的采食量达到每天220 mg/（kg·bw）时，大鼠的生长明显受到抑制；当采食量达到每天300 mg/（kg·bw）左右时，大鼠生长完全受到抑制；采食量超过每天300 mg/（kg·bw）时，大鼠体重出现负增长。推荐的凝集素在大鼠饲料中的安全限量应该控制在1.25 mg/g[12]。测定的11 个桑品种中，有9 个均能达到此标准，其中红顶桑的含量最低，沙2×109和甜桑2个桑品种略微超标，但是通过蒸煮、高温高压、辐射等处理亦很容易钝化凝集素的活性，达到推荐的安全限量标准。

植物凝集素和单宁在同一品种的不同成熟阶段、同一成熟阶段的不同部位含量均不同。对桑41、桑19、化稀3个桑品种上、中、下叶位的桑叶单宁和凝集素含量的测定结果表明，嫩叶中的含量低于老叶中的含量。

综上所述，伦教40、荷叶白、伦109等11个桑品种单宁含量在18.79 mg/g～28.46 mg/g之间，单宁含量均不高，因而，从凝集素的含量考虑选择饲料用桑，其优劣次序依次是红顶桑、伦教40、睦州青、荷叶白、粤桑11、伦109、抗青10、梧桐桑、桐乡青、甜桑、沙2×109，且嫩桑叶作为畜禽饲料比老熟桑叶有优势。