添加辣木叶和香肠乳杆菌对玉米秸秆青贮品质的影响

吕竑建， 邹 璇， 吴 硕， 李 云， 陈晓阳*， 张 庆*

(1.华南农业大学动物科学学院， 广东 广州 510642； 2. 华南农业大学林学与风景园林学院， 广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室， 广东 广州 510642； 3. 北京林业大学生物科学与技术学院， 北京 100083)

玉米(Zeamays)秸秆是世界上常见的农业副产品之一，其年产生物量超过11.3亿吨[1]。大部分的玉米秸秆都被焚烧处置，不仅造成了资源的浪费，同时带来了环境污染问题[2-3]。将玉米秸秆做成青贮饲料不仅能减少环境污染，且能缓解饲料短缺问题[4]。但玉米秸秆青贮饲料的局限性体现在其消化率和营养价值较低，作为单一饲料原料饲喂时难以满足动物日常营养需求，这是由于其木质纤维素和半纤维素含量高，蛋白质、氨基酸和矿物质含量较低，不利于有效微生物的生长。要提高玉米秸秆青贮的发酵质量，改善其营养价值和适口性，混合青贮是一个有效的办法[5]。

辣木(MoringaOleifera)，起源于印度，营养价值丰富，每一个部分都能被充分利用，且辣木能在非常恶劣的环境下存活，在全球广泛种植，蛋白质，维生素和微量元素含量高，是我们日常食用的水果蔬菜等食品的数倍[6-7]。鉴于辣木的特性，它可以用作饲料添加剂来改善饲料成分和利用效率，提高动物的健康水平[8-9]。Rubanza[10]报道将辣木作为饲料添加剂可以提高动物饲料消化率。Kholif[11]报道用辣木替代75%干物质的苜蓿(MedicagoSativa)，能提高哺乳期努比亚山羊的饲料利用率，改善瘤胃发酵，提高奶产量和质量。不仅如此，Wang[12]也报道用辣木叶和苜蓿或柱花草(Stylosanthesguianensias)混合青贮，能提高它们的营养价值和发酵品质。有氧稳定性是青贮饲料加工的重要指标，Wilkinson[13]研究发现玉米秸秆青贮容易在有氧环境下出现腐败，引起干物质损失甚至产生有毒物质。添加乳酸菌不仅可以改善玉米秸秆的青贮品质[14]，而且能提高青贮饲料的有氧稳定性，Ranjit[15]研究发现，在玉米秸秆青贮中添加布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri，LB)，能显著改善其有氧稳定性。根据我们此前的研究，在辣木青贮中分离出的香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis，LF)，可以提高青贮饲料的品质，对有氧稳定性的效果还有待探索[16]。

南方天气高温多雨，饲料保存难度大，容易出现霉变等腐败现象，然而饲料安全对动物养殖生产具有极其重要的意义，青贮是保存青绿饲料的一个经济便捷的方式。玉米秸秆的产量大，但营养价值低，混合辣木叶青贮可改善其营养品质，为我国南方地区提供优质的饲料资源。但有关于利用木本饲料混合青贮的方式改善其他牧草青贮品质的研究比较少，有关有氧稳定性的研究更是少之又少。所以，本试验采用完全随机试验设计，设置了100%玉米秸秆，80%玉米秸秆+20%辣木叶，60%玉米秸秆+40%辣木叶及是否添加LF共6个组别，在60 d青贮后测定了发酵品质等指标，并对青贮开袋后的8 d内的有氧稳定性进行了记录。旨在研究添加辣木叶和乳酸菌LF对玉米秸秆青贮品质，营养成分和有氧稳定性的影响，对开发木本饲料资源与现实生产提供理论依据和指导意义。

1 材料与方法

1.1 乳酸菌的制备

试验所用的辣木种植于华南农业大学试验田，并于2019年5月人工采叶，采叶后用铡刀进行切割，长度约2 cm，将切碎的辣木叶混合均匀，按照试验设计分装至聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中，每袋约200 g，真空封口机抽真空并密封保存。参照Zhang[17]的研究，经过60 d青贮发酵后，分离出96株乳酸菌菌株，并鉴定和筛选出LF，用于后续青贮试验。

1.2 试验设计

试验中的辣木和玉米均种植于华南农业大学试验田，玉米秸秆于玉米籽实收获后立即收割，辣木叶于第一次刈割后40天收割，采摘后处理和青贮方法同上。试验采用双因素完全随机试验，因素Ⅰ为辣木叶的添加量，因素Ⅱ是LF乳酸菌添加剂，添加量为1×106cfu·g-1鲜样(Fresh matter，FM)，分为6个组，分别是CK(空白对照组)，20%M(20%辣木叶和80%玉米秸秆混合青贮)，40%M(40%辣木叶和60%玉米秸秆混合青贮)，CK+LF(空白对照组+LF)，20%M+LF(20%辣木叶和80%玉米秸秆混合青贮+LF)，40%M+LF(40%辣木叶和60%玉米秸秆混合青贮+LF)，M代表辣木叶，每组9个重复，共54袋青贮。封装后在室温下保存，在60 d后进行开袋，对其化学成分，青贮品质和有氧稳定性进行测定分析。

1.3 有氧稳定性

参照Zhang[17]的方法对有氧稳定性进行测定。开袋后，每3袋收集400 g青贮，松散地放置在体积为1 L的塑料罐中，以评估有氧稳定性，共18罐，罐上覆盖一层纱棉布，让空气可以渗入青贮饲料，同时防止青贮变干和污染。所有的罐子都存放于纸箱(90 cm×50 cm×60 cm)中并以聚苯乙烯泡沫填满空间。每隔10 min测量一次室温和每个塑料罐的温度，记录仪型号(SMOWMDL-1048A，上海天河自动化仪器有限公司，中国上海)。

1.4 微生物及化学指标的测定

青贮开袋后，将20 g样品与180 mL无菌生理盐水溶液充分混合，并将其浓度依次从10-1稀释至10-6倍，得到不同浓度的样品浸提液，以平板计数法测定乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)、大肠杆菌(Coliform bacteria)、酵母菌(yeast)和霉菌(molds)的数量，乳酸菌采用MRS琼脂培养基，大肠杆菌采用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(Violet Red Bile Agar,VRBA)，酵母菌和霉菌采用孟加拉红培养基(虎红琼脂)。培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。为了检测pH值和有机酸含量，将20 g样品与180 mL无菌纯水充分混合，并置于4℃冰箱内18 h，取出过滤后即可测试pH值，剩余液体通过0.22 μm孔径的滤膜即可测定有机酸含量。氨态氮(Aammonium nitrogen，NH3-N)含量的测定方法参照Broderick[18]的方法。干物质(Dry matter，DM)含量的测定方法为在65℃烘箱内烘干48 h后计算。将烘干后的样品用粉碎机粉碎后置于干燥器保存，粗蛋白质(Crude protein，CP)含量的测定依照AOAC[19]的方法；非蛋白氮(Nonprotein nitrogen，NPN)和真蛋白质(True protein，TP)的含量测定方法参照Licitra[20]的方法；中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)的测定方法参照Van soest[21]的方法；可溶性糖(Water-soluble carbohydrates，WSC)的测定采用蒽酮比色法[19]。

1.5 数据统计

采用SPSS 19.0 进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，两个因素互作时用Duncan氏对各组进行多重比较，P< 0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 青贮原料

如表1所示，玉米秸秆和辣木叶原料的特性。玉米秸秆原料的干物质含量16.4%，CP含量为9.01%DM，NDF和ADF的含量为63.8%和36.1%DM，WSC含量为4.17%DM。微生物包括乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌和霉菌，数量分别为6.54，4.39，7.23和4.55 lgcfu·g-1FM。辣木叶原料的干物质含量20.4%，CP含量为22.1%DM，NDF和ADF的含量为23.3%和17.2%DM，WSC含量为7.36%DM。微生物包括乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌和霉菌，数量分别为5.72，3.53，7.00和<2.00 lgcfu·g-1FM。

表1 青贮原料的特性(± SD,n=3)Table 1 The characteristics of materials for ensiling (± SD,n=3)

2.2 秸秆辣木混合青贮60 d的青贮品质

如表2所示，玉米秸秆和辣木叶的青贮60 d后的青贮品质。添加辣木叶或LF均对DM无显著影响。添加辣木叶可以显著降低pH值(P<0.01)和大肠杆菌数量(P<0.01)，同时提升乳酸含量(P<0.01)。乳酸菌数量在添加40%辣木叶时显著降低(P<0.05)。乙酸含量在添加辣木后均有所下降，但仅在20%M组有显著差异(P<0.05)。辣木叶与LF的交互作用对乳酸菌，大肠杆菌和酵母菌的数量均有显著影响(P<0.05)。

表2 混合青贮60 d发酵品质(n=3)Table 2 The fermentation quality of the mixed silages after 60 d of ensiling (n=3)

2.3 秸秆辣木混合青贮60 d营养成分

表3 混合青贮60天营养成分(n=3)Table 3 The nutritional components of the mixed silages after ensiling for 60 days(n=3)

2.4 辣木秸秆青贮的有氧稳定性

如图1所示，开袋后8 d内温度变化的趋势。添加辣木叶后降低了青贮开袋后的有氧稳定性，但在添加LF后，有氧稳定性有明显的提升，并无有氧腐败的现象(表4)。达到最大温度用时为0的组别(CK，CK+LF，20%M+LF，40%M+LF)代表初始温度即为整个试验期内的最高温度。

表4 青贮60 d后开袋8 d内有氧稳定性(n=3)Table 4 The aerobic stability of the mixed silages 8 days after exposure to air

图1 混合辣木叶和添加乳酸菌LF对玉米秸秆青贮60 d后有氧暴露8 d温度变化的影响Fig.1 Effect of Moringa Oleifera leaves addition on the temperature dynamics of corn stover ensiled with/without LF for 60 days and subsequently exposure to air for 4 days

3 讨论

3.1 玉米秸秆与辣木叶原料的特点

本试验中玉米秸秆的粗蛋白质含量高于周瑞[22]的研究。辣木叶原料的粗蛋白质含量高于王成[23]报道的16.72%DM，而NDF，ADF和WSC的含量均低于其报道。但是辣木叶的WSC含量达到了张庆[24]报道的制作优质青贮饲料并良好保存的标准。原料的营养成分含量不同，可能是不同的地理位置、气温、品种和作物生长期等因素导致[23]。另外，两种原料的乳酸菌数量都达到了Cai[25]报道的良好青贮原料的标准(> 5.0 lg cfu·g-1)，但原料中较多的大肠杆菌数量可能会影响青贮效果。同时，玉米秸秆纤维含量高，WSC和DM含量低，青贮效果不理想[26-27]。将WSC含量低的饲草与WSC含量高的牧草混合青贮是改善青贮饲料质量的常见方法[5]。辣木叶蛋白质含量高，纤维含量低，是动物饲料的优质蛋白质来源。因此，将辣木叶与玉米秸秆混合青贮可提高其营养价值和青贮品质。

3.2 秸秆辣木叶混合青贮60 d的青贮品质

添加辣木叶混合青贮后，pH值显著降低，大肠杆菌数量显著下降。pH值是衡量青贮品质的重要指标[28]，一般来说，pH值<4.2表示青贮饲料的发酵品质良好[25]，较低的pH值还能抑制大肠杆菌的生长。据报道，辣木是一种有效的抗菌植物，能减少饲草中常见的有害微生物[29-30]，说明辣木叶在青贮中可能有一定的抗菌性能。乳酸菌数量的下降应该是较低的pH值所致，Ohmomo报道很多乳酸菌菌株对pH值<4.0的环境耐受性较弱[31]。本试验中，酵母菌仅出现在20%M和40%M组，Muck[28]报道称大部分酵母菌能在pH值为3.5的环境下存活，这远低于一般青贮饲料足以抑制大多数有害微生物的pH值。此外，添加辣木叶提高了乳酸和WSC含量，给酵母菌提供了生长条件。由于酵母菌在好氧条件下会引起青贮饲料变质，因此酵母菌数量的增加值得引起注意[4,28]。乙酸的产生常是由于乳酸被分解，添加辣木叶降低了乙酸的含量。此外，添加LF能抑制有害微生物的生长，说明LF能改善饲料的青贮品质。以上结果表明添加辣木叶和LF都能提升玉米秸秆的青贮品质。

3.3 秸秆辣木叶混合青贮60 d的营养成分

添加辣木叶可以显著降低氨态氮含量，可能是辣木叶抑制了梭菌等微生物的生长和蛋白质的水解活动。另一方面，Guo[32]报道辣木叶中的单宁成分可以抑制青贮饲料中的蛋白质水解。添加辣木叶显著增加了蛋白质含量，同时显著降低了纤维成分的含量。高水平的膳食纤维可能会使动物消化能损失，降低矿物质利用效率，并对生物生殖指标产生负面影响[33]。WSC含量在添加辣木叶后也有所提升(添加LF组)，一般来说，WSC含量代表青贮饲料发酵中糖的消耗。低pH值环境可能会抑制微生物的活动从而抑制青贮饲料的发酵[4]。WSC含量与乳酸含量相关，试验组中WSC含量低时，乳酸含量较高，发酵效果较好。从CK与CK+LF两组对比，可以看出，添加LF对促进玉米秸秆发酵有积极意义。不过，无LF组的WSC含量相近，且平均值比添加LF组高，也有可能是纤维酸水解导致的。

3.4 秸秆辣木叶混合青贮的有氧稳定性

有氧稳定性的定义为青贮饲料的核心温度高于外界温度2℃所需要的时间，是衡量青贮饲料质量的重要指标之一。有氧腐败会使饲料的营养价值下降，且降低动物的采食量[34]。当饲料暴露于空气中时，引起有氧腐败的主要因素是酵母菌，将碳水化合物和乳酸分解成水和二氧化碳[17]。从表4可知，仅2组出现了有氧腐败(20%M和40%M)。从图1可知，20%M和40%M2组均从第一天开始出现有氧腐败的现象，并一直保持较高的温度，而其他组未出现有氧腐败现象。出现有氧腐败的2组，正好是检测出酵母菌的2组，所以有氧腐败很可能是相关酵母菌引起的。He[35]也报道了类似的情况，添加辣木后降低了青贮的有氧稳定性，可能是由于辣木叶提高了青贮中乳酸和WSC含量，且降低了乙酸和丙酸等抗菌成分的含量。但是，通过添加LF可明显提高青贮的有氧稳定性，即使添加了辣木叶的玉米秸秆青贮也未出现有氧腐败，可能是LF抑制了酵母菌的生长。通过以上的试验结果表明，添加辣木叶可以改善玉米秸秆青贮的发酵质量，提高营养价值，而添加LF可提高玉米秸秆青贮的有氧稳定性。

4 结论

本研究表明，在玉米秸秆青贮中添加辣木叶可降低pH值、大肠杆菌数量，使乙酸、氨态氮、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量下降，同时辣木叶可以增加蛋白质和乳酸含量，但会降低青贮的有氧稳定性。香肠乳杆菌可以减少玉米秸秆青贮中大肠杆菌和酵母菌的数量，同时提高青贮的有氧稳定性。因此，将辣木叶与玉米秸秆混合青贮时，添加香肠乳杆菌能得到发酵效果更好，品质更优的青贮饲料。