纳米酶免疫层析试纸条法检测玉米褪绿斑驳病毒

符 娜，向 均，张永江，张祥林

(1.乌鲁木齐海关技术中心，乌鲁木齐 830011; 2.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

0 引 言

【研究意义】玉米极易受到检疫性病毒-玉米褪绿斑驳病毒(Maizechloroticmottlevirus，MCMV)的侵染。受该病毒的入侵的玉米，其主要症状是染病植株的叶片逐渐失绿、变黄，随后整片叶呈现黄绿相间的斑驳条斑[1]。当MCMV单独侵染会导致玉米产量降低10%～15%[2]。在田间MCMV与玉米矮花叶病毒(Maizedwarfmosaicvirus，MDMV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus，SCMV)及小麦线条花叶病毒(Wheatstreakmosaicvirus，WSMV)等马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的病毒进行复合侵染，引起严重的玉米致死性坏死病(Maizelethalnecrosisdisease，MLND)[3]，致使玉米产量损失高达90%[4]。MCMV可经玉米种子、介体甲虫、蓟马等方式传毒。目前MCMV在美国、秘鲁、阿根廷、法国、南非和澳大利亚等国家均有发生[5]，在我国部分地区也有发生报道[6]。纳米酶试纸条具有成本低，操作简单，适用范围广的优点。建立的纳米酶免疫层析试纸条在玉米褪绿斑驳病毒大范围传播之前具有提前预警的效果，也为缩短该病毒的快速检测时间。【前人研究进展】目前，用于鉴定和检测MCMV的方法主要包括血清学方法、分子生物学和纳米磁珠转换荧光检测法。Stenger D C[7]等提出酶联免疫吸附反应法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是最常见的用于MCMV的血清学检测方法。，Wen等[8]、Zhang等[9]分别根据该病毒外壳蛋白基因的保守序列，设计了特异性引物及TaqMan荧光探针，建立了检测MCMV的实时荧光RT-PCR方法。高利增等[10-17]提出了“纳米酶”的概念，纳米酶材料的出现，为检测该病毒提供了一种新的方法。【本研究切入点】目前，还未有文献报道MCMV纳米酶免疫层析试纸条的出现。将带有MCMV纳米酶标记的鼠抗体IgG与硝酸纤维素膜质控线上的鼠抗体结合，建立纳米酶免疫层析试纸条检测技术。【拟解决的关键问题】以MCMV为研究对象，将带有MCMV纳米酶标记的鼠抗体IgG与硝酸纤维素膜质控线上的鼠抗体结合，并在二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)的作用下进行显色，建立纳米酶免疫层析试纸条检测技术。

1 材料与方法

1.1 材 料

MCMV鼠抗IgG与甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)、水稻矮缩黑条病毒(rice black-streaked dwarf virus , RBSDV)、大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus, BYDV)、小麦线条花叶病毒(wheat streak mosaic virus，WSMV)毒源均来自中国检验检疫科学研究院。其它供试样品由海关截获，编号为1#～6#。

生化试剂：羊抗兔IgG纯化抗体、纳米酶溶液来自中国科学院生物物理研究所、聚氯乙烯板(PVC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA)、硝酸纤维素膜(NC)、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)显色试剂、植物总RNA提取试剂盒、Easy Script One-Step RT-PCR Super Mix。

供试仪器：XYZ三维划膜喷金仪(BioDot-XYZ)、微电脑自动斩切机(BioDot- cm5000)、磁力架(12孔)、PCR仪(WD-94028 D)、离心机(Eppendorf5425D)、超净工作台(SW-CJ-2F)、双频台式数控超声波清洗器(SK3200LHC)。

PCR引物：参照龚海燕等[2]的方法合成下列引物对。

MCMVF：5'ATGGCGGCAAGTAGCCGGTCTACCCGAGGTAGAA3'

MCMVR：5’TCAATGATTTGCCAGCCCTGGGCCTGGAACC3'

1.2 方 法

1.2.1 试纸条制备

将长度为2 cm的吸水垫、2.5 cm NC膜、1.5 cm的玻璃纤维膜依次贴在6 cm PVC上，制成空白试纸条。利用XYZ三维划膜喷金仪在空白试纸条的NC膜表面分别喷上间隔0.5 cm的羊抗鼠抗体(C线)，特异性的MCMV抗体(T线)。并在37℃烘箱中烘干，干燥保存。

1.2.2 样品制备

在研磨皿中放入0.1 g待测样品，加入液氮，充分研磨。后加入5 mL的1% BSA-PBS研磨；5 500 r/min离心20 min，取上清；再次离心，取上清，-20℃冷冻，保存备用。

1.2.3 抗体与纳米酶颗粒的偶联

取500 mL(1 mg/mL)纳米酶溶液，涡旋震荡混合，加1 mL ddH2O，并放入超声波清洗器中振荡30 s，弃上清液。将1 mL活化剂(NHS、EDC)添加至500 mL纳米酶溶液中，涡旋震荡混合后静置30 min。将50 mg MCMV抗体与450 mL醋酸钠溶液(50 mM, pH=6.0)混合，添加至纳米酶溶液中，振荡混匀，置于旋转混匀仪中避光孵育4℃过夜。将孵育溶液放置磁力架上，澄清后弃上清，加入1 mL终止液(Tris-Hcl)并置于旋转混匀仪(4℃，3 h)，弃上清。加入1 mL 的5%BSA-PBS，超声混匀，置于旋转混匀仪(4℃，3 h)上震荡，弃上清。加入500 mL的1% BSA-PBS，制成抗体纳米酶偶联复合物，储存于4℃冰箱中。

1.2.4 样品检测

将上述抗体纳米酶偶联复合物用1% BSA-PBS稀释5倍，震荡混匀，制成纳米酶稀释液。取65 mL待测样品研磨液，将其与5.5 mL纳米酶稀释液混合，滴加至试纸条加样孔，层析15 min。最后将1 mL配制好的DAB底物液滴入用棉花覆盖的显色窗中，显色7 min。若试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性；仅出现C线，则检测结果为阴性；出现T线，则检测结果无效，需重新测试。

1.2.5 样品RNA提取

用植物总RNA提取试剂盒提取MCMV叶片，将提取的该病毒RNA按梯度稀释，-20℃保存备用。取待测样品1#～6#号，用植物总RNA提取试剂盒提取各待测样品RNA, -20℃保存备用。

1.2.6 待测样品RT-PCR扩增检测

取各待测样品(1#～6#)RNA，分别放入PCR管，每管中分别加入2× One step Reaction Mix 25 mL，RNA-Free H2O 18.6 mL，上游引物0.8 mL，下游引物0.8 mL，Enzyme Mix 0.8 mL，RNA 4 mL，充分混合均匀后置于PCR仪中，50℃反转录30 min；94℃预变性10 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共28个循环；72℃延伸8 min后结束反应；PCR反应产物送生物技术公司做基因测序。

2 结果与分析

2.1 纳米酶试纸条检测灵敏度

研究表明，NISA方法的灵敏度是RT-PCR法的100倍。图1，图2

注：1.空白对照；2.10-3；3.10-4；4.10-5；5.10-6；6.10-7；7.10-8

注：1.空白对照；2.10-1；3.10-2；4.10-3；5.10-4；6.10-5

2.2 纳米酶试纸条特异性

研究表明，仅有MCMV出现C线和T线，其它病毒只出现了C线，未出现T线，也无其它非特异性吸附，该试纸条具有良好的特异性。图3

注：1.空白对照；2.MCMV；3.RBSDV；4.SCMV；5.BYDV；6.WSCV

2.3 纳米酶试纸条检测待测样品

研究表明，在3个样品(1#、2#和6#、)的C线和T线分别出现了红褐色条带，检测结果为阳性；在3份样品中(3#、4#、5#、)C线出现了红褐色条带，T线无显示，检测结果为阴性。所有阳性样品的核苷酸序列与已报道的GeneBank库中(GU594293.1)MCMV序列高度一致，一致性达99.56%。纳米酶试纸条法检测供试样品中携带MCMV的结果可靠。图4，图5

注：1.空白对照；2. 2～7供试样品(1#～6#)

注：1.空白对照； 2～7待测样品(1#～6#)。

3 讨 论

纳米酶试纸条对玉米褪绿斑驳病毒的研磨液灵敏度的检测，同RT-PCR相比具有更高的灵敏度，在检测过程中会有植物组分对试纸条背景色的影响，可以通过稀释研磨液解决。试纸条对其它4种病毒进行特异性验证，验证结果表明，该试纸条只能检测玉米褪绿斑驳病毒,对其它病毒非特异性吸附。抗体的特异性在很大程度上影响试纸条特异性检测该病毒。随机选取的待测样品进行检测，试纸条检测结果与RT-PCR以及基因测序结果一致，表明该试纸条检测结果可靠。

试纸条在检测、储存时间上需要进一步改善。不同大小尺寸的纳米酶对试纸条灵敏度的影响。目前，该试纸条还无法同时检测侵染玉米的多种病毒，也无法做到定量检测，这是后续需要开展的研究。

4 结 论

纳米酶试纸条检测MCMV研磨液的灵敏度比RT-PCR检测MCMV的灵敏度高100倍，应用该方法检测其它4种病毒也具有良好的特异性。纳米酶试纸条检测6份供试样品，其中3份为阳性，3份为阴性；经RT-PCR法及基因测序法验证检测结果可靠。该方法具有较高的灵敏度、良好的特异性以及检测结果可靠的优点。