甜菜红素喷雾干燥粉抗氧化活性及其咀嚼片的研制

刘琪龙，韩海霞，包晓玮，钟志明，马 强

(新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】甜菜红素(Betacyanin)是一种天然食用色素，广泛存在于苋科、藜科、紫茉莉科、商陆科等多种植物中，属于酮、醌类衍生物[1]。研究甜菜红素喷雾干燥粉(Betacyanins spray-dried powder，BSP)抗氧化作用及其咀嚼片的研制，对红甜菜作为功能保健食品开发利用有重要意义。【前人研究进展】Ashwini等[2]提出富含甜菜红素的食品具有作为功能性食品的潜力。甜菜红素在食品领域正式批准使用[3]。Vidal[4]发现甜菜红素可抑制前列腺素和白三烯的生成，表明其可有效灭活环氧化酶和脂氧化酶。甜菜红素可有效缓解百草枯对大鼠造成的肝损伤和肺损伤间质性肺炎[5,6]。Farabegoli等[7]发现甜菜红素对CaCo-2肿瘤细胞的细胞毒作用明显增强。吕思润等[8]研究发现，甜菜红素使细胞中的CAT和SOD活性提高，且可修复因H2O2造成的细胞损伤。郝秀梅等[9]研究结果表明，红甜菜水提物及其用X-5纯化后的色素均有较强的抗氧化能力。【本研究切入点】甜菜红素具有量好的抗氧化作用，但甜菜红素类功能性食品鲜有报道。近年来，经x-5纯化的甜菜红素具有抗氧化作用[8,9]，而实验采用DEAE-52纤维素从红甜菜提取液中提取分离制得甜菜红素浓缩汁，再利用纳滤和喷雾干燥技术将该浓缩汁制备成甜菜红素喷雾干燥粉(Betacyaninspray-dried powder，BSP)[10]。研究BSP抗氧化活性及其咀嚼片的研制。【拟解决的关键问题】以BSP作为供试品，研究其体外抗氧化作用，并以其为原料，以木糖醇、甘露醇、麦芽糊精、微晶纤维素、山梨糖醇为辅料，采用湿法制粒压片制备BSP咀嚼片，为红甜菜作为功能保健食品开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

甜菜红素喷雾干燥粉(BSP)，由新疆农业大学食品科学与药学学院包晓玮副教授制备并提供，木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、微晶纤维素、麦芽糊精、硬脂酸镁等试剂均为市售国产食品级。

1.1.2 试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(纯度>97%，上海源叶生物科技有限公司)、2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺(ABTS)(纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司)；铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、无水乙醇、过硫酸钾、双氧水、硫酸亚铁等试剂均为市售国产分析纯。

1.1.3 仪器

AL204-IC电子分析天平(梅特勒-托利多仪器，上海有限公司)，硬度测量仪(上海黄海药检仪器有限公司)，DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，SX-4-10型箱式电阻炉控制箱(天津市泰斯特仪器有限责任公司)，ZWY-200D智城恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)，TG16-W型高速离心机(湘仪责任有限公司)，标准分样筛(20、80目)(浙江上虞市标准分样筛厂)，T-6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 BSP的制备

将红甜菜粉碎，过滤，采用DEAE-52纤维素分离制备甜菜红素提取液，经纳滤膜过滤，浓缩，所得甜菜红素浓缩液的色价为1 150.5 /mL，利用喷雾干燥技术将该浓缩液制备成BSP，BSP含有甜菜红苷0.97 mg/g、甜菜红素0.02 mg/g、仙人掌黄素0.07 mg/g。

1.2.2 BSP抗氧化实验1.2.2.1 DPPH自由基清除能力

参照任薇等[11]的方法稍作改进，取2 mL浓度分别为40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP样品，加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)，混匀，避光，于受控温度(25±2)℃下静置30 min，于517 nm处测得吸光度，VC为阳性对照，按公式(1)进行计算。

(1)

式中，A1：2 mL样品液+2 mL DPPH乙醇溶液；

A2：2 mL样品液+2 mL无水乙醇；

A0：2 mL DPPH+2 mL 75%乙醇溶液。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力

参考Li等[12]方法，取浓度分别为40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP样品0.8 mL，加入3.2 mL ABTS工作液，混匀，避光，于受控温度(25±2)℃下静置6 min，在734 nm处测定其吸光度。以VC溶液作为阳性对照，按公式(2)进行计算。

(2)

式中，A1：样品液+ABTS溶液混合液；

A2：样品液+蒸馏水；

A0：蒸馏水+ABTS溶液混合液

1.2.2.3 羟基自由基清除能力

参照廖国会等[13]的方法，取浓度分别为40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP样品1 mL，加入硫酸亚铁(1.5 mmo1/L)、双氧水(9 mmol/L)和水杨酸(9 mmol/L)各l mL，混匀，置于摇床使其反应(37℃，30 min)，于510 nm处测定吸光度；按公式(3)进行计算。

(3)

式中，A1：1 mL样品液+1 mL FeSO4+1 mL H2O2；

A2：1 mL样品液+1 mL FeSO4+1 mL H2O；

A0：1 mL H2O+1 mL FeSO4+1 mL H2O2。

1.2.2.4 还原能力

参照Lee等[14]的方法，取40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP样品、PBS(pH 6.6)和铁氰化钾(1%)各1 mL，混匀后，于水浴反应(50℃，20 min)，冷却后，加入1 mL三氯乙酸(10%)，离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液2 mL，加入2 mL蒸馏水，0.4 mL六水氯化铁(1%)，混匀，反应10 min。蒸馏水作为空白对照，VC溶液作为阳性对照，700 nm处测定吸光度[15]。

1.2.3 BSP咀嚼片制备工艺1.2.3.1 工艺流程

木糖醇、甘露醇、麦芽糊精、微晶纤维素、山梨糖醇

↓

甜菜红素→配料→制软材→湿法制粒→干燥→整粒→压片

↑

硬脂酸镁

1.2.3.2 咀嚼片感官评分标准

感官评定小组由12名食品专业研究生组成，以咀嚼片的色泽、口感、外观、质地为评价指标，分别对辅料比(木糖醇:甘露醇:麦芽糊精:微晶纤维素:山梨糖醇)、原料(BSP)与辅料比、柠檬酸添加量、硬脂酸镁添加量、润湿剂进行单因素筛选，确定BSP咀嚼片的制备工艺。列出BSP咀嚼片感官评价标准[15]。表1

表1 BSP咀嚼片感官评分标准Table1 Sensory scoring criteria for BSP

1.2.3.3 辅料比例对BSP咀嚼片感官评价

设定原料与辅料比为1∶2，硬脂酸镁和柠檬酸添加量均为1%，辅料比例分别为4∶2∶1∶1∶1、4∶2∶2∶1∶1、4∶3∶2∶1∶1、4∶4∶3∶1∶1、4∶4∶1∶2∶2。制得BSP咀嚼片，进行感官评定，确定辅料比例。

1.2.3.4 原料与辅料比例对咀嚼片感官评价

设定辅料比为4∶4∶3∶1∶1，硬脂酸镁和柠檬酸添加量均为1%，原料与辅料比例分别为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3，按“1.2.3.1”下方法制得BSP咀嚼片，进行感官评定，确定原料与辅料比例。

1.2.3.5 柠檬酸添加量对BSP咀嚼片感官评价

咀嚼片的口味一般以甜味为主，微酸，入口有凉爽感为宜，柠檬酸为常用的矫味剂，可以改善咀嚼片口感。设定原料与辅料比为1∶2，辅料比为4∶4∶3∶1∶1，硬脂酸镁添加量为1%，柠檬酸添加量分别为0、0.5%、1%、1.5%、2%，按“1.2.3.1”方法制得BSP咀嚼片，进行感官评定，确定柠檬酸添加量。

1.2.3.6 硬脂酸镁添加量对BSP咀嚼片感官评价

设定原料与辅料比为1∶2，辅料比为4∶4∶3∶1∶1，柠檬酸添加量为1%，硬脂酸镁添加量分别为0、0.5%、1%、1.5%、2%，制得BSP咀嚼片，进行感官评定，确定硬脂酸镁添加量。

1.2.3.7 润湿剂对BSP咀嚼片感官评价的影响

润湿剂不具有粘性，但喷洒后可以诱发物料本身的粘性，方便制成软材，选择蒸馏水、50%乙醇、75%乙醇、无水乙醇作为润湿剂，以软材过筛情况、制粒效果和粘冲情况为指标，确定最适润湿剂。

1.3 数据处理

在实验中测定抗氧化指标时，对每个指标至少进行3次重复测定，使用Excel-2016软件对数据进行基础处理，使用SPSS-20.0软件分析试验数据，进行描述性统计。结果由Origin-2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 BSP抗氧化

2.1.1 对DPPH自由基的清除能力

研究表明，当浓度在40～1 280 μg/mL，BSP对DPPH自由基的清除能力具有剂量依赖性，在40～320 μg/mL，BSP对DPPH清除率涨幅较大，BSP对DPPH清除率的IC50为109.65 μg/mL，VC为42.51 μg/mL。图1

图1 BSP对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by BSP

2.1.2 对ABTS自由基的清除能力

研究表明，当浓度在40～1 280 μg/mL，BSP对ABTS自由基清除能力具有剂量依赖性，在40～320 μg/mL浓度，BSP对ABTS清除率呈线性增加，BSP对ABTS清除率的IC50为260.49 μg/mL，VC为78.54 μg/mL。图2

图2 BSP对ABTS自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of ABTS free radicals by BSP

2.1.3 对羟基自由基的清除能力

研究表明，当浓度在40～1 280 μg/mL，BSP对羟基自由基的清除能力具有剂量依赖性，在40～320 μg/mL浓度范围内，BSP对羟基自由基清除能力快速增强，BSP清除羟基自由基的IC50为89.59 μg/mL，VC为95.93 μg/mL。图3

图3 BSP对羟基自由基的清除率Fig. 3 Scavenging rate of hydroxyl radical by BSP

2.1.4 BSP还原能力测定

研究表明，随着浓度的增加，反应体系的吸光度增大，BSP还原能力随浓度增加而增强，表现出良好的量-效关系，在40～1 280 μg/mL浓度范围内，BSP和VC的还原力相当。图4

图4 BSP还原能力Fig. 4 BSP reduction capacity

2.2 BSP咀嚼片制备工艺

2.2.1 辅料比例对BSP咀嚼片感官评价的影响

研究表明，随着辅料比例(木糖醇∶甘露醇∶麦芽糊精∶微晶纤维素∶山梨糖醇)的变化，BSP咀嚼片的感官评分呈先升高后降低的趋势，当辅料比例为4∶2∶1∶1∶1时，因麦芽糊精和甘露醇占比较少，导致BSP咀嚼片粉粒感较大且甜度较小，当辅料比例为4∶4∶3∶1∶1时，BSP咀嚼片的色泽均匀，无杂质，甜度适中，外观光洁平整，质地良好，当辅料比例为4∶4∶1∶2∶2时，BSP咀嚼片有粘牙感，选用辅料比例为4∶4∶3∶1∶1。图5

图5 不同辅料比例下BSP咀嚼片感官评价Fig.5 Effect of excipient ratio on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.2 原料与辅料比对咀嚼片感官评价的影响

研究表明，随着原料(BSP)与辅料比例的变化，BSP咀嚼片感官评分呈现先升高后降低的趋势，当原料与辅料比例为1∶1时，BSP咀嚼片味道偏淡，当原料与辅料比例为1∶2时，BSP咀嚼片呈紫红色，色泽均匀且红甜菜风味突出，当原料与辅料比例为1∶3时，BSP咀嚼片甜度偏高且红甜菜风味不突出。原料与辅料比例为1∶2时较为合适。图6

图6 不同原料与辅料比下BSP咀嚼片感官评价Fig.6 Effect of raw material to adjuvant ratio on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.3 柠檬酸添加量对BSP咀嚼片感官评价的影响

研究表明，随着柠檬酸添加量的增加，BSP咀嚼片的感官评分呈现先升后降的趋势，当柠檬酸添加量为0时，BSP咀嚼片甜度过高而发腻，使其口感不佳，当柠檬酸添加量为1%时，BSP咀嚼片口感细腻，酸甜可口，当柠檬酸添加量为2%时，BSP咀嚼片酸度较大，掩盖了红甜菜的风味。柠檬酸添加量为1%较为合适。图7

图7 不同柠檬酸添加量下BSP咀嚼片感官评价Fig.7 Effect of citric acid addition on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.4 硬脂酸镁添加量对BSP咀嚼片感官评价的影响

研究表明，随着硬脂酸镁添加量的增加，感官评分呈现先升后降的趋势，当其添加量小于1%时，物料粘性过小，制得BSP咀嚼片粉粒感明显，从而使其口感不佳，当硬脂酸镁添加量为1.5%时，物料粘性良好，制得BSP咀嚼片无粉粒感，外观光洁、无明显裂痕，且硬度适中，当硬脂酸镁添加量为2%时，物料粘性大，制得BSP咀嚼片偏硬。硬脂酸镁添加量为1.5%较为合适。图8

图8 不同硬脂酸镁下BSP咀嚼片感官评价Fig.8 Effect of magnesium stearate on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.5 润湿剂对BSP咀嚼片感官评价的影响

研究表明，物料与蒸馏水混合后，所得软材质粘性大，出现结块现象，硬度较大，不易过筛；与50%乙醇混合后，所得软材粘性较大，颗粒不均匀，过筛后颗粒大小不均匀；与75%乙醇混合后，所得软材粘性适中，且过筛后颗粒均匀；与无水乙醇混合后，软材粘性较小，过筛后颗粒均匀，但细粉过多，然而细粉过多会导致咀嚼片粉粒感明显，且易出现裂痕，硬度较小，选择75%乙醇为润湿剂。表2

表2 不同浓度乙醇做润湿剂Table 2 Experimental results of different concentrations of ethanol as wetting agents

2.2.6 验证试验

研究表明，3批BSP咀嚼片呈紫红色片剂，色泽均匀，其外观光洁圆整，厚度均匀，口感细腻，酸甜可口，具有甜菜红素风味，且无颗粒感，硬度适中，最终感官评分分别为(90.23±0.81)、(90.31±1.01)、(89.88±0.79)分，其平均分为(90.14±0.87)分。表3

表3 验证实验结果Table 3 Verification experiment results

3 讨 论

DPPH测定法是一种快速、简便、灵敏、可行的评价天然抗氧化剂抗氧化活性的，在国内外应用广泛[16]。DPPH清除自由基的机理是在加氢抗氧剂的存在下，DPPH还原为DPPH-H，导致紫色褪色，从而抑制氧化反应[17]。张灵帮等[18]研究得出，红肉火龙果果皮和白肉火龙果果皮中甜菜红素对DPPH自由基清除率的IC50分别为950、1 150 μg/mL，刘冰等[19]发现火龙果果皮甜菜红素浓度为6 000 μg/mL时，对DPPH自由基的清除率为55%左右，郝秀梅等[9]研究结果表明，经x-5纯化的红甜菜色素浓度为2 000 μg/mL时，对DPPH自由基的清除率为80%左右，试验中，当BSP浓度为640 μg/mL时，其清除率即可达81.16%，当BSP浓度为1 280 μg/mL时，其清除率达92.23%，BSP对DPPH自由基具有更强清除能力。

ABTS自由基因氧化剂存在会形成稳定的蓝绿色自由基[20]，而当有抗氧化剂存在时，ABTS自由基溶液会发生褪色。实验基于抗氧化剂通过H原子转移的自由基淬灭或通过单电子转移的还原，对稳定自由基ABTS产生清除能力[21]。吕思润等[8]研究发现，经x-5纯化的甜菜红色素浓度为800 μg/mL时，对ABTS自由基的清除率为36%。试验中，当BSP浓度为800 μg/mL时，其清除率达70%左右，表明BSP对ABTS自由基具有较强的清除能力。

羟基自由基作为一种活性氧，能快速与机体内多种分子发生反应，造成细胞突变或死亡。从而对机体的损伤也最大[22]。张灵帮等[18]研究得出，红肉火龙果果皮和白肉火龙果果皮中甜菜红素对羟基自由基清除率的IC50分别为4 570、5 950 μg/mL，刘冰等[19]发现火龙果果皮甜菜红素浓度为6 000 μg/mL时，对羟基自由基的清除率为60%左右，吕思润等[8]研究结果表明，经x-5纯化的甜菜红素浓度为400 μg/mL时，对羟基自由基的清除率为57%左右，试验中，当BSP浓度为160 μg/mL时，其清除率即可达54.31%，当BSP浓度为1 280 μg/mL时，其清除率达91.26%，表明BSP具有更强的羟基自由基清除能力。

抗氧化剂能使铁氰化钾的三价铁还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾和三氯化铁反应生成Fe4[Fe(CN)6]3，其在700 nm处有最大吸收，因此，可间接测定抗氧化剂还原能力的大小，即吸光度值越大，还原能力越强[23]。郝秀梅等[9]的研究表明，经x-5纯化的红甜菜色素浓度在250～2 000 μg/mL，其还原力弱于VC，而试验中，BSP浓度在40～1 280 μg/mL范围内，BSP和VC的还原力相当。

甜菜红素是一种天然食用色素，具有较高的保健价值与酸碱稳定性[24]。选用不同抗氧化活性评价体系，通过多方面及不同机制探讨BSP的抗氧化活性，表明BSP具有较好的体外抗氧化活性。

4 结 论

4.1 BSP对DPPH、ABTS和羟基自由基均有一定的清除作用，其IC50分别为109.65、260.49、89.59 μg/mL，BSP在40～1280 μg/mL浓度下，还原能力与VC相当。

4.2 BSP咀嚼片的最佳配方为：辅料比例(木糖醇∶甘露醇∶山梨糖醇∶微晶纤维素∶麦芽糊精)为4∶4∶3∶1∶1，原料(BSP)与辅料比例为1∶2，柠檬酸和硬脂酸镁添加量分别为1%和1.5%，润湿剂为75%乙醇。

4.3 BSP具有良好的抗氧化活性，以其为原料制备的咀嚼片，呈紫红色，色泽均匀，酸甜可口，厚度均匀，硬度适中。