UPLC-MS/MS法测定人血浆和脑脊液中利奈唑胺的浓度

范理菊，吴 茵，董占军1,

(1.河北医科大学研究生学院，石家庄 050017；2.河北省人民医院药学部，石家庄 050051)

医院获得性颅内感染是颅脑术后最严重的并发症之一，发生率为2.6%，病死率高达21%[1]。G+菌是颅内感染的主要病原菌[2]。利奈唑胺的组织穿透力强，口服生物利用度高，对中枢神经系统G+菌感染有很好的疗效[3]，是治疗神经外科术后医院获得性颅内感染的常用药物。研究发现，利奈唑胺在无脑膜感染人群中的脑脊液药-时曲线下面积与血浆药-时曲线下面积的比值约为0.7[4]，具有良好的中枢神经系统渗透性，但个体间药动学参数差异较大。并且当患者的病理、生理状态变化时，其药动学参数也会随之改变[5-6]。因此，在治疗患有中枢神经系统感染的重症患者时，有必要对其进行治疗药物监测，以优化个体化给药方案[7]。国外已有利奈唑胺在脑膜感染患者中的药动学研究，并推荐了使用剂量[8-9]，但利奈唑胺在国内神经外科术后颅内感染患者的脑脊液及血浆中药动学研究资料非常有限[10]。本研究建立了UPLC-MS/MS法测定血浆及脑脊液中利奈唑胺的浓度，从而探究利奈唑胺血浆浓度与脑脊液浓度的相关性，从而为利奈唑胺在术后颅内感染患者的药动学研究提供方法学基础。国外已有两种基质中利奈唑胺浓度测定的报道[11-12]，目前国内报道的有两项研究[13-14]，均采用HPLC法，其特异性和灵敏度不及LC-MS/MS法。考虑到同位素稀释质谱是国际公认的一级测量原理[15]，因此本研究建立同位素稀释的UPLC-MS/MS法测定人血浆和脑脊液中利奈唑胺浓度，可以在3 min内完成血浆和脑脊液中利奈唑胺浓度测定，简便、高效、经济，适用于临床测定危重症患者血浆和脑脊液中利奈唑胺的浓度。

1 材 料

1.1 仪器 LC-30A 型超高效液相色谱仪，配有 CTO30A 型柱温箱、SIL30AC 型自动进样器、LC-30AD二元高压梯度泵(日本 Shimadzu 公司)；AB Sciex 5500型串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源、三重四级杆质量分析器；Analyst 1.6.1数据采集软件(美国AB公司)。

1.2 药品和试剂 利奈唑胺对照品(批号1029-084A1)、利奈唑胺-d3对照品(批号1219-006A2)由美国TLC公司提供；人工脑脊液(批号0316A20，北京雷根生物技术有限公司)；二甲亚砜(DMSO)、乙腈、甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.5 μm),柱温：40 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，梯度洗脱(0～1.0 min，80%～35%A，1.0～2.1 min，35%～80%A)；流速：0.5 ml/min；进样量：3 μl。

2.2 质谱条件 正离子监测模式；离子源温度600 ℃；源喷射电压5500 V；雾化气和加热气压力均为55 psi(1 psi=6.894 76 kPa)；气帘气35 psi；多反应监测(MRM)模式；利奈唑胺监测离子对为m/z338.1→295.9，去簇电压(DP)110 eV，碰撞电压(CE)32 eV；利奈唑胺-d3的监测离子对为m/z341.3→297.2，DP 110 eV，CE 30 eV。利奈唑胺和内标的质谱图见图1。

图1 利奈唑胺和内标的质谱图Figure 1 Mass spectrograms of linezolid and internal standardA:利奈唑胺；B:内标利奈唑胺-d3

2.3 溶液的配制 (1)标准曲线工作液：精密称取利奈唑胺对照品适量，加DMSO溶解，配成质量浓度为1.00 mg/ml的对照品储备液。取对照品储备液适量，用乙腈-水(2∶8)稀释，配制成质量浓度分别为2、4、10、20、50、100、150、200 μg/ml的系列对照品溶液，作为标准曲线工作液。(2)质控工作液：另取对照品储备液，用乙腈-水(2∶8)稀释，配制成质量浓度分别为5、40、160、400 μg/ml的质控工作液。上述溶液置于4 ℃冰箱保存备用。(3)内标溶液:精密称取利奈唑胺-d3适量，用DMSO溶解，配制成质量浓度为1.00 mg/ml的内标储备液。取内标储备液适量，用乙腈稀释，配制成质量浓度为0.2 μg/ml的内标溶液，置4 ℃冰箱冷藏保存。

2.4 样品预处理

2.4.1 血浆样品预处理 取血浆样品40 μl，加入内标溶液200 μl，沉淀蛋白质，涡旋5 min后，以相对离心力1.372 6×104×g高速离心8 min，取上清液20 μl，加入乙腈-水(2∶8)380 μl，混匀，备测。

2.4.2 脑脊液样品预处理 取脑脊液样品40 μl，加入内标溶液200 μl，沉淀蛋白质，涡旋5 min，以相对离心力1.372 6×104×g离心8 min，取上清液20 μl，加乙腈-水(2∶8)380 μl，混匀，备测。

2.5 专属性 取空白血浆样品及定量下限的血浆样品各6份，按2.4项下方法处理并进样分析。脑脊液样品参照血浆样品。结果显示，利奈唑胺和内标出峰位置背景干净，无杂峰干扰。血浆样品中利奈唑胺和内标的保留时间分别为1.18和1.17 min；脑脊液样品中利奈唑胺和内标的保留时间分别为2.25和2.24 min。见图2。

2.6 标准曲线的制备

2.6.1 血浆样品的标准曲线 取空白血浆380 μl，精密加入系列浓度的标准曲线工作液各20 μl，涡旋混匀，配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/ml的标准曲线用血浆样品。取空白血浆380 μl，精密加入系列浓度的质控工作液，配制成质量浓度分别为0.25、2、4、8 μg/ml的质控血浆样品。按2.4.1项下方法处理并进样分析。以血浆中待测物的质量浓度(x)为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(y)为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y=0.531x+0.006 35(r=0.999 4)。结果表明，利奈唑胺血药浓度检测的线性范围为0.1～10.0 μg/ml，定量下限为0.1 μg/ml。

2.6.2 脑脊液样品的标准曲线 取人工脑脊液380 μl，精密加入系列浓度的标准曲线工作液20 μl，涡旋混匀，配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/ml的标准曲线用脑脊液样品。取人工脑脊液380 μl，精密加入系列浓度的质控工作液，制成质量浓度分别为0.25、2、4、8 μg/ml的质控脑脊液样品。按2.4.2项下方法处理并进样分析，以脑脊液中待测物的质量浓度(x)为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(y)为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y=0.479x-0.002 65(r=0.999 8)。利奈唑胺脑脊液浓度检测的线性范围为0.1～10.0 μg/ml，定量下限为0.1 μg/ml。

2.7 稳定性试验 取利奈唑胺低、高质量浓度(0.25、8 μg/ml)质控血浆样品各6份，按2.4.1项下方法处理并进样分析，分别考察其冻融3次、冷冻7 d及室温放置6 h的稳定性。脑脊液样品的稳定性考察方法同血浆样品操作，结果见表1。结果显示，各样品RSD均<10%，提示该方法稳定性良好。

表1 血浆和脑脊液样品的稳定性试验结果Table 1 Results of stability test of plasma and cerebrospinal fluid samples (n=6，%)

2.8 准确度试验和精密度试验 取利奈唑胺定量下限、低、中、高质量浓度的质控血浆样品各5份，按2.4.1项下方法处理，进样检测，考察日内精密度；连续测定3 d，考察日间精密度。脑脊液样品的精密度和准确度测定方法同血浆样品操作。结果显示，各质控样品的日内、日间RSD均<10%，见表2。

表2 血浆和脑脊液中利奈唑胺的精密度和准确度试验结果Table 2 Results of precision and accuracy tests of linezolid in plasma and cerebrospinal fluid samples (%)

2.9 提取回收率和基质效应 平行制备低、高质量浓度的质控血浆样品各6 份，按照2.4.1项下方法处理后进样分析，记录峰面积为 C。空白血浆按照2.4.1项下方法提取后，添加低、高质量浓度的血浆样品，每个质量浓度平行制备 6 份，进行色谱分析，记录峰面积为 B。同浓度的质控工作溶液，不经处理直接进样，记录峰面积为 A。提取回收率=(C/B)×100%，基质效应=(B/A)×100%。脑脊液样品的基质效应和提取回收率测定同血浆样品，结果见表3。

表3 血浆和脑脊液中利奈唑胺的基质效应和提取回收率Table 3 Matrix effects and extraction recoveries of linezolid in plasma and cerebrospinal fluid

2.10 稀释可靠性 将血浆样品用空白血浆稀释10倍,平行制备6份，按2.4.1项下方法处理并进样分析。脑脊液样品的稀释可靠性操作同血浆样品，精密度和准确度结果见表2。结果显示，样品稀释10倍对浓度测定无显著影响。

3 讨 论

利奈唑胺脂溶性高、分子质量小、血脑屏障穿透性好,现已广泛用于治疗G+菌所致的中枢神经系统感染[16]。郭明星等报道了用LC-MS/MS法测定利奈唑胺血浆药物浓度，但采用的是非同位素内标[17-18]。本研究采用利奈唑胺-d3同位素内标，色谱分析条件下，利奈唑胺和内标有相近的色谱保留时间，被分析物的出峰时间不受时间限制，同时利奈唑胺与内标具有相似的离子化效率和提取回收率[19]，最大程度地降低了基质效应，提高了利奈唑胺浓度测定的准确度。

本研究采用梯度洗脱方式，以甲酸水溶液(含0.1%甲酸，V/V)为流动相A相，乙腈为流动相B相。在流动相中加入0.1%甲酸提高了利奈唑胺的离子化效率和检测灵敏度。血浆样品中组分复杂，采用梯度洗脱的方式，可以使复杂样品中性质差异较大的组分易于分离，缩短分析时间。预实验还比较了不同比例的乙腈-水溶液(2∶8和3∶7)对实验的影响。结果发现，用2∶8的乙腈-水溶液作为溶剂，在准确度、精密度、基质效应等方面更符合实验要求。常用的生物样本预处理方法有固相萃取法、液液萃取法和蛋白沉淀法。固相萃取法时间短，效率高，但成本高。液液萃取法操作繁琐、费时，不适用于医院常规样品的批量测定。本研究采用乙腈为沉淀剂的前处理方法，操作简便、成本低廉、提取回收率高，适用于医院的治疗药物监测。本研究还将内标溶解于沉淀剂中，一是减少了因内标加样量少引起的人为误差，二是简化了样本预处理步骤，缩短了预处理时间，为临床危重症患者的药物治疗争取了时间。

综上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS同位素稀释法可以满足临床患者血浆和脑脊液中利奈唑胺的浓度测定，值得推广应用。