基于响应面法的五行香草方挥发油提取工艺研究和体外抑菌作用评价

闫红敏，于兰兰*，郭子燕（.河南省直第三人民医院药学部，郑州 450000；.河南中医药大学第二临床医学院，郑州 450000）

五行香草方是本院中医专家在《备急千金要方》中避温病方“粉身散”的基础上以加减，经大量临床实例总结出的治疗脚气病的外用方，取得了较好的疗效，该方由川芎、藁本、白芷、防风、细辛组成，可作用于足底特殊穴位，对脚气、脚臭、骨刺等有显著的治疗作用[1]。该方的有效成分多为挥发性成分，挥发油又是中药“辛”味的重要物质基础，也是该类中药发挥治疗作用的主要物质基础之一，即中药“辛”味与挥发油、表证和炎症关系密切[2-3]，且挥发油分子量小、脂溶性较强，容易穿过体内生物膜，生物利用度高，能快速吸收起效[4]。在前期的临床观察中，将中药粉通过一定的工艺制成中药鞋垫使用，制作工艺复杂、重复利用率低，本实验拟通过优选工艺提取五行香草方中的挥发油，并通过体外抑菌实验观察其抑菌效果，为进一步改进工艺、优化剂型提供依据。

1 材料

1.1 仪器

挥发油提取器（北京新科实验室玻璃仪器有限公司），2015年版《中国药典》药典筛（浙江上虞市道墟五四仪器厂），DT-400电子天平（北京医用激光仪器厂常熟分厂），FW-600高速万能粉碎机、MH3000电子调温电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 试药

白芷（批号：B712191-01）、川芎（批号：B810103-01）、防风（批号B710304-01）（河北楚风中药饮片有限公司），细辛（批号：170701，湖北聚瑞中药饮片有限公司），藁本（批号：1707005，江西樟树天齐堂中药饮片有限公司），经河南中医药大学第一附属医院陈天朝主任药师鉴定，符合《中国药典》各品种项下规定。细菌培养基血琼脂平板（批号：20191010B）、真菌培养基为沙保罗培养基（批号：20191007B）（安图生物科技有限公司）。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌（批号：A0291B，广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心）；白假丝酵母菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌均由河南省直第三人民医院检验科临床分离所得。

2 方法与结果

2.1 提取方法

称取100 g五行香草方全粉，过筛，加入适量蒸馏水，置于圆底烧瓶中，常压加一定量蒸馏水，室温下浸泡一定时间，连接挥发油提取器，提取一定时间，收集提取物，并加适量石油醚（60～90℃）萃取。精密读取挥发油体积，计算其提取率，提取率（%）＝提取量（mL）/全粉质量（g）×100%。

2.2 单因素实验

查阅文献[5-7]，分别设置粉末等级、浸泡时间（h）、提取时间（h）、液固比4个因素，每个因素设置5个水平，以挥发油提取率为指标对影响因素进行初步筛选。

2.2.1 粉末等级 选择浸泡时间2 h，提取时间3 h，液固比12∶1，考察粉末等级为原饮片、最粗粉（粒径70～13 μm）、粗粉（粒径29～9.9 μm）、中粉（粒径9.9～7.6 μm）、细粉（粒径7.6～6.6 μm）时对五行香草方挥发油提取率的影响，结果见图1A。

图1 各因素对五行香草方挥发油提取率的影响Fig 1 Effect of various factors on the extraction rate of volatile oil in Wuxing vanilla formulae

当粉末等级由饮片至粗粉时，挥发油提取率呈明显的上升趋势；粉末等级为粗粉时，挥发油提取率达到峰值；当粉末由中粉到细粉时，五行香草方的挥发油提取率呈现下降趋势。粉末等级从粗粉至细粉时，五行香草方的挥发油提取率逐渐减低，这是由于粉末过细，置于圆底烧瓶中沸腾提取挥发油时容易糊化，影响挥发油提取率，故粉末等级以粗粉为宜。

2.2.2 浸泡时间 选择粉末等级为粗粉，提取时间为3 h，液固比为12∶1，考察浸泡时间为0、1、2、3、4 h对五行香草方挥发油提取率的影响，结果见图1B。随着浸泡时间的增加，挥发油提取率呈明显的上升趋势，至2 h后趋于平衡，3、4 h时挥发油提取率无明显上升。故浸泡时间以2 h为宜。

2.2.3 提取时间 选择粉末等级为粗粉，浸泡时间为2 h，液固比为12∶1，考察提取时间为1、2、3、4、5 h对五行香草方挥发油提取率的影响，结果见图1C。随着提取时间的延长，挥发油提取率呈现上升趋势；当提取时间为3 h时，挥发油提取率达到峰值，延长时间提取率无明显上升，故提取时间以3 h为宜。

2.2.4 液固比 选择粉末等级为粗粉，浸泡时间为2 h，提取时间为3 h，考察液固比为6∶1、9∶1、12∶1、15∶1、18∶1对五行香草方挥发油提取率的影响，结果见图1D。当液固比为6∶1、9∶1时，该方的挥发油提取率无明显变化；当液固比为12∶1时，挥发油提取率呈明显上升趋势；当液固比为15∶1、18∶1时，挥发油提取率呈现略微的下降趋势。故选择液固比12∶1为宜。

根据上述单因素试验结果，初步筛选的较优的提取条件为粉末等级为粗粉、浸泡时间2 h、提取时间3 h、液固比12∶1。最终选择浸泡时间1～3 h，提取时间3～5 h，液固比为9∶1～15∶1进行响应面设计，优化五行香草方的挥发油提取工艺。

2.3 Box-Behnken响应面法优化挥发油提取工艺

选取浸泡时间（X1）、液固比（X2）、提取时间（X3）为考察变量，挥发油提取率（Y）为响应值，采用Box-Behnken design（BBD）实验设计方案[8]，进行三因素三水平的响应面分析对工艺参数进行优化，设计17组实验点。因素与水平表见表1，实验设计与结果见表2。

表1 因素与水平表Tab 1 Factor and level

表2 Box-Behnken响应面法实验设计与结果Tab 2 Design and results of Box-Behnken response surface method

应用Design Expert软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到Y对X1、X2、X3之间的二次多项回归方程为Y＝1.44＋0.11X1＋0.045X2＋0.041X3－0.0025X1X2＋0.025X1X3－0.018X2X3－0.076X12－0.054X22－0.091X32；剔除不显著项后Y＝1.44＋0.11X1＋0.045X2＋0.041X3＋0.025X1X3－0.018X2X3－0.076X12－0.054X22－0.091X32。由方程可知，各因素对方中挥发油提取率的影响大小排序为X1＞X2＞X3，即浸泡时间＞液固比＞提取时间。对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。

从表3可以看出该模型P＝0.0007＜0.001，说明该响应面回归方程模型显著；且模型失拟项P＝0.0704＞0.05不显著，说明方程对实验拟合较好。模型中X1、X2、X3、X12、X22、X33项具有显著性，表明各个自变量与因变量间的线性关系较为明显，对各因素绘制曲面图和等高线图，更能直观地反映各因素对响应值的影响以及最优条件下各因素的取值结果，详见图2。

图2 各因素对五行香草方挥发油提取率的曲面图和等高线图Fig 2 Surface plot and contour map of various factors to extraction rate of volatile oil in Wuxing vanilla formulae

表3 Box-Behnken响应面法方差分析Tab 3 Variance analysis of Box-Behnken response surface method

根据Box-Behnken响应面法实验所得结果和二次多项回归方程，采用Design Expert软件拟合可得最优工艺条件为浸泡时间2.39 h，液固比14.36∶1，提取时间4.30 h，在此条件下得到的挥发油得率为1.50%。

为验证结果的可靠性，平行精密称定五行香草方3份，每份100 g，对模型优化的工艺进行验证。考虑到实验的可操作性与便捷性，选择工艺参数浸泡时间为2.5 h、液固比14∶1、提取时间4 h对3批样品进行提取工艺验证，计算挥发油提取率，求其平均值为1.51%（RSD＝0.77%，n＝3），与理论预测值基本吻合。

2.4 五行香草方挥发油抗菌活性测定

2.4.1 挥发油的提取 按“2.3”项下优化方法提取白芷、川芎、防风、细辛、藁本及五行香草方中的挥发油。

2.4.2 抑菌片的制备 取无菌干燥、直径为6 mm的滤纸片，每片滴加挥发油30 μL浸润，然后将滤纸片平放于无菌培养皿中，置于室温下干燥后备用；另取同样无菌干燥、直径为6 mm的滤纸片，每片滴加灭菌水30 μL，干燥后作为对照无菌片；在无菌条件下，用接种环分别挑取一环金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌接入研钵中，以少量生理盐水进行研磨，直至均匀，即得供试菌悬液[9]。

2.4.3 抗菌活性的测定 采用滤纸片法测定挥发油的抑菌圈[10]。精密吸取各供试菌悬液100 μL分别涂布于相应的培养基平板上；在无菌操作下，每种挥发油均取3片抑菌片和1片对照无菌片贴放在相应菌液的固体培养基平板上并将对照无菌片置于平板中心。实验菌群为金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌时，在37℃恒温条件下培养24 h；实验菌为红色毛癣菌、石膏样小孢子菌时，在26℃恒温条件下培养7 d，重复3 次，观察结果，并计算出抑菌环的平均直径，结果见表4。

表4 不同挥发油抑菌实验(±s，n＝3)Tab 4 Antibacterial test of different volatile oils (±s，n＝3)

表4 不同挥发油抑菌实验(±s，n＝3)Tab 4 Antibacterial test of different volatile oils (±s，n＝3)

注（Note）：对照无菌片无抑菌作用（The control sterile tablets had no antibacterial effect）。

供试液抑菌环直径/mm金黄色葡萄球菌白假丝酵母菌红色毛癣菌石膏样小孢子菌细辛挥发油11.2±0.268.9±0.3312.7±0.1210.1±0.09白芷挥发油6.3±0.167.1±0.437.3±0.086.6±0.26防风挥发油8.5±0.367.3±0.148.9±0.099.3±0.22川芎挥发油6.2±0.146.3±0.146.2±0.056.5±0.37藁本挥发油6.8±0.098.0±0.346.8±0.227.2±0.14五行香草方挥发油10.9±0.089.1±0.1813.5±0.2912.7±0.24

结果表明，五行香草方中各饮片提取的挥发油对金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌均有抑制作用，抑菌效果为金黄色葡萄球菌：细辛＞五行香草方＞防风＞藁本＞白芷＞川芎；白假丝酵母菌：五行香草方＞细辛＞藁本＞防风＞白芷＞川芎；红色毛癣菌：五行香草方＞细辛＞防风＞白芷＞藁本＞川芎；石膏样小孢子菌：五行香草方＞细辛＞防风＞藁本＞白芷＞川芎。

3 讨论

中药挥发油是从芳香中药中提取出来的一类化学成分复杂、药理活性广泛的油状液体[11]，本实验中提取的中药复方挥发油的抑菌强度强于单味中药饮片，表明复方配伍对抑菌效果有一定的增效作用。且前期研究表明，方中诸药均有不同程度的抑菌抗菌作用[12-20]，复方抑菌作用强于单味中药，说明方中各药味间存在明显的协同作用，中药复方配伍对挥发油的化学成分和含量存在一定的影响。若要进一步阐明抑菌物质基础，可对该复方进行更为深入的GC、GC-MS研究，分析单味药与复方挥发性成分的组成及含量，为五行香草方的抑菌效果提供确切的理论依据，为后期的剂型优化提供物质基础。