AMPKα1/TLR4通路在老年糖尿病肾病病人中的表达及与NF-κB、TGF-β1水平的相关性研究

李晓艳 张汝 程莹 莫立稳

糖尿病肾病是糖尿病病人最为常见的合并症之一，且我国发病率呈上升趋势，成为终末期肾脏病的第二位原因(仅次于各种肾小球肾炎)[1]。糖尿病肾病病人由于存在复杂的代谢紊乱，病程发展到终末期肾脏病后，将会增加临床治疗难度[2]。临床研究表明：糖尿病肾病的发生常伴有炎症因子的共同参与，能通过Toll样受体4(TLR4)通路加剧病情发展[3]。腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)抑制肾脏炎症反应，采取有效措施提高AMPK通路，能影响TLR4的生物活性[4-5]。NF-κB是P50和RelA 两个亚基组成的二聚体，其构成的信号系统在细胞应激反应、细胞因子应答及自由基损伤中发挥了重要作用[6]。NF-κB信号系统在糖尿病肾病中发挥了重要作用，但是其具体调控机制尚未阐明。转化生长因子-β1(TGF-β1)属于一种新发现的调节细胞生长、分化的TGF-β超家族成员，能改变成纤维细胞贴壁生长特性，从而获得在琼脂中生长的能力，在炎症、组织修复中发挥重要作用。本研究旨在探讨AMPKα1/TLR4通路在老年糖尿病肾病病人中的表达及与NF-κB及TGF-β1水平的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年3月至2019年5月我院老年糖尿病肾病病人126例作为对象，设为观察组，符合糖尿病肾病诊断标准[7]，血肌酐<106μmol/L；HbA1c<8.0%。观察组病人均经肾脏活检确诊，男71例，女55例；年龄60～84岁，平均(74.98±5.61)岁；病程1～12年，平均(6.39±0.71)年； BMI为20～27，平均23.19±3.23；合并症：高血压12例，高脂血症7例。另选取同期81例病人作为对照组，均为肾脏切除病人(非糖尿病肾病)，未侵犯肾脏周围组织，男49例，女32例;年龄60～85岁，平均(75.11±5.64)岁；病程1～11年，平均(6.43±0.77)年； BMI为21～28，平均23.31±3.29；病因：无功能结核肾32例，肾细胞癌36例，无功能积水肾13例；合并症：糖尿病5例，高血压8例，高脂血症5例。排除标准：(1)合并血液系统疾病、急慢性肾小球肾炎的病人；(2)冠脉介入术后、慢性心功能疾病或慢性泌尿系感染者；(3)精神异常、认知功能异常或凝血功能异常者。

1.2 方法

1.2.1 AMPKα1/TLR4 mRNA水平测定：(1)实时荧光PCR检测。①标本采集：观察组在B型超声引导下行经皮肾活检(左肾)；对照组行肾脏切除术(1/2左肾)，2组将获得的肾组织放置在液氮中，保存，备用。②标本处理：从液氮中取出肾脏组织，经10.0%中性福尔马林24 h固定，经脱水、透明、浸蜡及常规包埋后行连续切片。③总RNA提取：向3组血清标本中加入氯仿200μL， 15 s振荡，5 min静置后15 min离心，离心力1216 g。去除上层清液，加入预冷的乙醇(浓度75.0%)1 mL，常温下7 min干燥；经紫外分光度仪A260下测定吸光度值。④实时荧光PCR检测：设置PCR参数：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，连续进行35个循环，72 ℃ 10 min延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin为内对照。根据2-△△Ct公式完成相关参数测定：△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct；△△Ct=观察组△Ct-对照组△Ct。为了提高试验测定的准确性，降低检测过程中的人为误差，对细胞标本均完成3次测定，取平均值，见表1。

表1 引物设计

(2)HE染色。取上述制备的切片标本，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸各5 min，放入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各3 min，梯度酒精，操作完毕后用蒸馏水冲洗，放入苏木素染色液5～15 min，自来水冲洗待细胞核变蓝后镜检。对于背景颜色偏深的标本，放入1%盐酸酒精完成数秒分化，放入自来水中完成10～30 min蓝化，采用蒸馏水冲洗，伊红染色完成1～3 min，常规酒精脱水后二甲苯透明，树胶封固，倒置显微镜下观察[8]。

1.2.2 NF-κB、TGF-β1水平测定：观察组与对照组入院后次日清晨，取卧位姿势，经肘静脉采集外周血5 mL，35 min离心，速度3000 r/min，血清分离后放置在-80℃冰箱中，备用。采用ELISA法测定NF-κB、TGF-β1水平[9]。

2 结果

2.1 AMPKα1/TLR4 mRNA水平比较 观察组的AMPKα1/TLR4 mRNA为1.43±0.08，显著低于对照组(2.78±0.11)(P<0.01)。

2.2 HE染色结果比较 HE染色结果表明：观察组肾小球毛细血管基底弥漫性增厚，伴有纤维化，且小动脉管壁内膜增厚，部分组织中伴有明显水肿，符合糖尿病肾病病理特点；而对照组肾小球及肾小管均未见明显病变，亦未见纤维化，见图1。

注：A图为观察组肾脏组织HE染色结果；B图为对照组肾脏组织HE染色结果图1 2组HE染色结果比较(×200)

2.3 NF-κB、TGF-β1水平比较 观察组的NF-κB、TGF-β1水平均高于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组NF-κB、TGF-β1水平比较

2.4 老年糖尿病肾病病人AMPKα1/TLR4表达与NF-κB、TGF-β1的相关性 Pearson相关分析结果显示，老年糖尿病肾病病人AMPKα1/TLR4表达与NF-κB、TGF-β1水平均呈负相关性(P<0.01)，见表3。

表3 老年糖尿病肾病病人AMPKα1/TLR4表达与NF-κB、TGF-β1的相关性(r，P)

3 讨论

随着我国经济的不断发展，糖尿病发生率呈上升趋势，导致糖尿病肾病发生率亦呈增长趋势。糖尿病肾病是糖尿病病人最主要的微血管病变之一，亦是病人死亡的主要原因。目前，临床上对于糖尿病肾病发病机制尚未阐明，现代医学治疗多以强化血糖控制，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统为主，但是远期预后较差。糖尿病肾病病人常处于慢性、低度炎性反应状态，是慢性并发症共同的致病机制[10]。Toll样受体(TLRs)是模式识别受体，在免疫反应中发挥了重要作用，属于激活固有免疫的重要信号通路，能在配体的刺激下传递炎症信号，从而引起炎症细胞浸润、炎症因子的释放。国外学者的研究表明：TLR4是从哺乳动物中发现的Toll样受体，在炎性疾病中发挥了重要的作用；而AMPK属于机体重要的能量调节开关，能作为第二信使与多条信号通港路有关，可直接参与细胞蛋白质的合成，亦可调节氧化应激、改善炎症作用[11]。国内学者的研究表明：AMPK在糖尿病肾病中发挥了重要作用，能引起高血糖、高血脂，亦可激活TLR4活性[12]。本研究中，观察组AMPKα1 mRNA、AMPKα1 mRNA水平均低于对照组(P<0.05)。HE染色结果表明：观察组肾小球毛细血管基底弥漫性增厚，伴有纤维化，且小动脉管壁内膜增厚；而对照组肾小球及肾小管均未见明显病变，亦未见纤维化。说明AMPKα1/TLR4通路在老年糖尿病肾病病人中呈低表达，且常伴有肾脏病理改变，能直接参与疾病的发生、发展。

TGF-β1属于人体内较为常见的炎症因子，能直接参与组织修复、胚胎的发育。临床研究发现,TGF-β1能参与细胞的生长、分化，在免疫调节中发挥了重要的作用[13]。TGF-β1在人体中能抑制免疫活性细胞的增殖，亦可调节细胞的表型，抑制淋巴细胞、细胞因子的分化，可促进成纤维细胞、成骨细胞的生长。TGF-β1在正常人体中表达水平较低或处于动态平衡状态，但是在糖尿病肾病病人中将呈高表达，能直接参与疾病的发生、发展。NF-κB是真核细胞中具有多向调节功能的转录因子，是糖尿病/糖尿病肾病微血管病发生的调节因子。在正常人体中，NF-κB以无活性的诱导形式存在于细胞浆中，当遇到应激、损伤、炎症等各种致病因子时，NF-κB水平将呈高表达，能与细胞黏附分子、细胞因子相互作用，发挥良好的调节功能[14]。本研究中，观察组NF-κB、TGF-β1水平均高于对照组(P<0.01)，说明NF-κB、TGF-β1在老年糖尿病肾病病人中呈高表达，能反映病人疾病的严重程度，而且AMPKα1/TLR4表达与NF-κB、TGF-β1水平均呈负相关性(P<0.01)。因此，老年糖尿病病人应加强AMPKα1/TLR4表达及NF-κB、TGF-β1水平测定，辅助临床诊疗，延缓病情进展。

综上所述，AMPKα1/TLR4、NF-κB以及TGF-β1在老年糖尿病肾病病人中表达异常，可能直接参与疾病的发生、发展，能为临床治疗提供了新靶点。