模拟海洋大气环境下生物矿化膜抑制低合金钢腐蚀行为研究

赵倩玉，惠芯蕊，王亚楠，高珊，张才毅，郭章伟，郭娜，刘涛

（1.上海海事大学，上海 201306；2.宝山钢铁股份有限公司，上海 201900）

低合金钢由于其良好的力学性能，广泛应用于海洋工程领域，但是其在海洋环境中极易腐蚀，特别是在海洋大气区，因此大气腐蚀是导致金属钢结构失效的重要原因之一[1-3]。大气腐蚀在不同区域，具有不同的特性[4-5]。当空气的相对湿度小于100%时，低合金钢极易受到腐蚀，这是由于水分在低合金钢表面凝聚，金属表面会出现极薄的水膜，空气中的氧极易通过水膜到达金属表面，造成金属的氧去极化腐蚀。当相对湿度为100%时，由于在海水上方，水膜中总是含有溶解的盐，故低合金钢的腐蚀是在电解质液膜下进行的，这类腐蚀与全浸于海水中的电化学腐蚀过程类似[6-7]。

为了减少金属由于大气腐蚀造成的损失，多位研究者通过现场挂片或实验室实验来获得腐蚀数据，进而提出改进方法，采取相应的防护措施。目前最主要的防护措施为在材料表面进行涂装处理[8-9]，涂料将金属和大气分隔的同时，涂料中的颜填料还会和金属发生化学反应，在金属表面形成钝化膜来保护材料。此外，还有人利用超疏水的特性，研制新型的防护材料，从而有效阻止金属表面液膜/液滴的形成[10]；或者针对性地研发性能更优良的耐候钢，从根本上对材料作出调整，进行防护[11]。这些措施均可有效改善材料的大气腐蚀，但是存在着成本较高、对环境不友好等不足。本文将通过微生物的矿化作用提高低合金钢的耐大气腐蚀性能，从而为海洋材料的大气腐蚀防护提供一种新思路。

笔者课题组前期研究发现，由微生物诱导产生的矿化膜在海水中对金属具有良好的保护作用。微生物会在金属表面形成一层有机-无机的杂化膜，这种杂化膜与金属具有良好的结合力，不易剥落[12-13]，且非常致密，可以阻碍氯离子和氧的渗入，使金属基体免受侵蚀。

笔者课题组之前的研究主要集中在生物矿化膜对海水腐蚀的抑制，但对在海洋大气中的保护效果并未进行深入探究。大气腐蚀和海水腐蚀存在一定的差别，其差异性主要源于金属表面电解质薄液膜的厚度，薄液膜的厚度会影响氧气到达金属表面的难易程度[14-15]。于是，基于已有的研究，本文对预形成的生物矿化膜进行了大气中金属腐蚀的测试实验，由此做进一步的探究。

本文使用电化学的方法（电化学阻抗、极化曲线）研究了生物矿化膜在薄液膜下对于低合金钢的保护效果，并结合扫描开尔文探针测试技术，原位检测薄液膜腐蚀环境下生物矿化膜对金属的保护性能，探究了生物矿化膜在海洋大气环境下的腐蚀防护机制。

1 试验

1.1 样品制备

本文使用的低合金钢（EH32）由宝钢（中国上海）提供。低合金钢的主要成分为：Mn 1.52%，Cr 0.15%，Ni 0.7%，Al 0.04%，C 0.055%，其余为铁。样品用环氧树脂封好，留出1 cm×1 cm 的工作区域，将其用碳化硅砂纸从120 目逐级打磨至1000 目，然后用酒精清洗，再放入超声仪中超声10 min，去除表面杂质。最后，用去离子水清洗样品表面，并氮气吹干，放置于紫外下照射灭菌30 min，备用。

1.2 细菌培养

本文用于制备生物矿化膜的细菌为一种假交替单胞菌（P. lipolytica），由中科院南海所王晓雪研究员提供。用接种针将得到的菌株从固体培养基上转接到 2216E 液体培养基锥形瓶中，放置于 37 ℃、120 r/min 的摇床上培养24 h，使菌液浓度达到5×106CFU/mL。培养基的主要成分为：1.0 g/L 酵母提取物，5.0 g/L 蛋白胨，0.1 g/L 柠檬酸铁，19.40 g/L NaCl，5.90 g/L MgCl2，3.24 g/L Na2SO4，1.80 g/L CaCl2，0.55 g/L KCl，0.16 g/L Na2CO3，0.08 g/L SrBr2，0.08 g/L KBr，0.034 g/L SrCl2，0.022 g/L H3BO3，0.004 g/L NaSiO3，0.0024 g/L NaF，0.0016 g/L NH4NO3和0.008 g/L Na2HPO4。

1.3 生物矿化膜的制备

向装有200 mL 灭菌后的2216E 液体培养基中接入100 μL 扩培后的菌液，将灭菌备用的样品浸入其中，放置于37 ℃、120 r/min 摇床上培养7 d，每隔3 d 更换一半2216E 液体培养基。7 d 后，将表面形成矿化膜的样品取出，用去离子水清洗，并氮气吹干，放入干燥箱保存，以便进行后续实验。

1.4 液膜电化学测试

生物矿化膜在薄液膜下的三电极电化学测试装置如图1 所示，薄液膜的厚度主要由欧姆表螺旋调节器和一根铜针进行调节控制。当铜针和液膜接触时，欧姆表上的针就会跳动。该装置的精确度为10 μm。薄液膜所处环境的相对湿度和温度分别控制在70%、25 ℃。另外，装置中配有一个加湿器，以避免液膜厚度发生变化。

将液膜调节到指定厚度后，使用电化学方法测试了矿化膜对金属的保护性，使用AutoLab 电化学工作站（Metrohm, Switzerland）测试了不同液膜厚度下的阴极极化曲线和不同浸泡时间下的电化学阻抗谱（EIS）。低合金钢作为工作电极，铂片作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极。在测量电化学阻抗谱之前，对样品的OCP 进行至少30 min 的监测，以达到稳定状态。EIS 测量的频率范围为0.01～1×105Hz，交流激励信号峰值为±5 mV。阴极极化曲线的电位扫描范围从开路电位到–1.7 V。最后使用Zsimpwin 软件来拟合电化学阻抗数据。实验所使用的电解质溶液为去离子水和纯NaCl 配制的5%中性NaCl 溶液。因为大气液膜中的盐度更大，条件也更苛刻，所以在5%时腐蚀最严重。

1.5 生物矿化膜宏观观察与扫描开尔文探针（SKP）测试

扫描开尔文探针技术目前已广泛应用在大气腐蚀机理的研究中，是一种分辨率达纳米级的微区电化学测试技术。通过该技术可以得到金属表面的电偶电位差，从而判断金属表面的局部腐蚀倾向[16-18]。本实验中，生物矿化膜在50 μm 薄液膜环境中长期浸泡，分别在1 h 及1、12、24、30 d 时，将样品取出，使用数码相机进行拍照，并使用SKP（Bio-logic M470，France）测试样品表面的电位变化。使用SKP 扫描样品表面，扫描范围为6 mm×2 mm，探针振幅为30 μm，探针到样品表面的距离保持在100 μm，扫描的步长为50 μm，且所有SKP 测试均在室温下进行。探针与生物矿化膜之间的电位差Vkp与腐蚀金属电极的腐蚀电位Ecorr具有线性关系：Ecorr=Vkp+C（C为常数项，可通过实验确定）。由测得的Vkp可得出生物矿化膜在盐雾中电位差的变化规律[19-22]。

1.6 表面形貌及成分分析测试

采用原子力显微镜（AFM）测定生物矿化膜的晶体结构分析，扫描频率为 0.977 Hz，扫描面积为600 nm×600 nm，扭矩为0.4 N/m。在Scan Asyst 模式下，使用Si3N4探针进行测试。此外，利用高分辨透射电子显微镜对细菌诱导的矿物进行分析。在分析之前，将0.1 mL 培养14 d 的P. lipolytica菌液放置在铜网上。使用10 μm 的孔径选定区电子衍射（SAED）模式对一个直径大约0.2 μm 的圆形区域进行分析。使用扫描电子显微镜（SEM, JEOL JSM-7500 F）对腐蚀后的生物矿化膜进行表征，观察样品表面和截面的腐蚀形貌。利用傅里叶红外光谱（FTIR，Vertex 70,Bruker, Germany）对未浸泡和薄液膜浸泡30 d 后的生物矿化膜表面的官能团进行分析[23]，扫描范围为400～4000 cm−1。使用ACE Recommended Pratice 0775-1999 Protocol（NACE, 1999）的方法去除样品表面的生物矿化膜和腐蚀产物[24]。将样品依次浸入盐酸-氮氮二丁基硫脲溶液、饱和NaHCO3溶液和去离子水中（各2 min），利用3D 光学轮廓仪（Bruker，Germany）对钢的表面形貌进行观察。此外，对形成生物矿化膜的试样表面进行 XRD 测试（PANalytical X′Pert PRO XRD，40 kV，10 mA，Cu-Kα 辐射源，扫描范围为2θ=10°～90°），进行物相鉴定。

2 结果及分析

2.1 表面形貌及成分分析

为了证明P. lipolytica菌株形成的生物矿化膜结构，在第24 d 对金属试样表面形成的生物矿化膜进行了多个位置的横截面扫描和原子力显微镜（AFM）成像。由图2a 可以看出，样品表面生物矿化膜的厚度约为43 μm，并且膜和金属基体之间的界面是紧密闭合的。AFM 图像显示，矿化膜为均匀致密的山丘状，其粗糙度大约为650 nm（见图2b）。对P. lipolytica细胞的TEM 分析表明，有纳米级大小的矿化产物（直径约为200～400 nm）嵌入附着在细菌细胞壁上的EPS中（见图2c）。根据SAED 图，笔者认为这些纳米级的矿化产物为多晶碳酸钙镁盐和非晶结构胞外多糖的混合物（见图 2d）。通过高分辨透射电镜（HRTEM）分析表明，矿化产物为至少3 个晶面的多晶结构。矿化产物的晶面间距分别为 0.25、0.30、0.38 nm，对应于(110)、(104)和(012)晶面（见图2e）。试样表面XRD 的测试结果（图2f）表明，Mg.064Ca.936CO3是其表面的主要成分，与图2d 的结果相对应。

浸泡14 d 后，形成生物矿化膜的样品及其在50 μm 液膜条件下腐蚀24、30 d 的表面形貌如图3所示。图3a 为生物矿化膜未腐蚀时的表面形貌，可以看到样品表面非常致密，并且有很多三角形结构的晶体紧密相连。当生物矿化膜在薄液膜下浸泡24 d后（见图3b），虽然此时生物矿化膜表面出现了一些缺陷，但仍然为很多三角形结构的物质相互交联在一起。在薄液膜下浸泡30 d 后（见图3c），金属表面三角形结构部分消失。这可能是由于样品表面矿化膜中的碳酸盐与空气中的二氧化碳、水发生了反应，矿化膜中不溶性的碳酸钙镁盐变成了微溶性的碳酸氢盐，矿化膜发生了溶解现象，之前出现的小孔被疏松的腐蚀絮状物所覆盖、填充。因此，在薄液膜下浸泡30 d 后，生物矿化膜的防护性能可能会下降。样品表面矿化膜和腐蚀产物共存，由于薄液膜极薄，腐蚀产物并未在薄液膜溶液中剥离，而是填充在生物矿化膜的空隙中。

由图4 的光学轮廓图可以看到，在薄液膜下浸泡24 d（见图4a），去除腐蚀产物膜以后，低合金钢的表面未受到明显的腐蚀，且未出现明显的点蚀，说明此时生物矿化膜依然可以保护金属免受侵蚀。在薄液膜下浸泡30 d 后（见图4b），低合金钢表面出现了明显的点蚀坑，最深达到了26 μm，说明生物矿化膜的防护效果下降。对比没有形成生物矿化膜的样品去除腐蚀产物后的光学轮廓图（图4c），其腐蚀程度是相对较轻的。

形成生物矿化膜的样品在薄液膜下浸泡30 d 后的FTIR 图见图5。从指纹谱图可以看出，生物矿化膜中方解石的特征峰主要是V2、V3、V4，其峰值分别为876、1426、712 cm–1。1426 cm–1V3的振动峰源于有机质和无机矿物的振动重叠，故没有振动峰V2、V4的峰值那么尖锐[25]。在红外光谱中观察到有机物的振动峰，1690 cm–1处的峰值代表羧酸的C=O 振动，2520 cm–1处的峰值为羧酸中—OH 的伸缩振动，在2500～3000 cm–1内观察到有机物的C—H 伸缩振动，3429 cm–1的峰值是由于O—H 的振动[26-27]。这些结果表明，该生物矿化膜是由有机质和方解石组成的有机-无机杂化膜。从图5 中还可以看出，生物矿化膜在薄液膜下浸泡30 d 后，羧酸的C=O 振动峰几乎消失。—OH 伸缩振动峰、有机物中的C—H 伸缩振动峰的峰值，明显比未在薄液膜下浸泡的生物矿化膜的振动峰小。这表明生物矿化膜中的有机物随着时间的增长，逐渐溶解在了薄液膜中。同时结合SEM图可知，矿化膜中的碳酸钙镁盐也发生了溶解。故此时的矿化膜无法再隔绝薄液膜溶液中的Cl–和氧气，Cl–和氧气通过有机物溶解的缝隙到达金属表面，造成了金属的腐蚀。

图5 生物矿化膜在薄液膜下浸泡30 d 后的FTIR 图Fig.5 FTIR diagram of biomineralized film soaked for 30 days in thin liquid film

2.2 生物矿化膜在薄液膜下的电化学分析

形成生物矿化膜的样品在不同液膜厚度下浸泡30 min，电位稳定后的阴极极化曲线如图6 所示。由于阳极极化会引起工作电极的溶解，从而明显改变薄液膜，因此样品在薄液膜下的腐蚀速率主要受阴极反应影响。当液膜很薄时，电流会富集在电极边沿，导致电流分布不均，从而影响试验结果[28-29]。对于金属的腐蚀，阴极反应主要为氧还原反应。因此，研究薄液膜下生物矿化膜对金属的保护性能主要是利用阴极极化曲线，判断氧气是否经扩散的方式通过了生物矿化膜到达低合金钢表面，使金属发生氧的还原反应，从而使金属遭到破坏。由图6 的极化曲线图中可以看出，矿化膜在液膜厚度为50 μm 时，腐蚀电流密度最大，而在其他液膜厚度下，腐蚀电流密度差别不大，说明矿化膜在液膜厚度为50 μm 时受到氧的去极化作用最为严重。因此，选择液膜厚度为50 μm。

阴极极化曲线研究的是腐蚀最初行为，不能对生物矿化膜长时间的保护性能进行检测，而电化学阻抗谱采用较小的扰动电位，对于电化学过程造成的影响是可以忽略的，因此电化学阻抗测试成为了研究薄液膜下长期腐蚀的重要监测手段。在薄液膜下，EIS 可以克服溶液欧姆下降的问题，从而得到更加准确的结果。同时根据电化学阻抗谱，不仅可以获得金属腐蚀速率的信息，还可研究腐蚀过程和腐蚀机理。

图6 生物矿化膜在不同液膜厚度下的阴极极化曲线Fig.6 Cathodic polarization curves of biomineralized membranes at different liquid film thicknesses

覆盖有生物矿化膜的低合金钢在薄液膜下的阻抗谱随时间的变化如图7 所示。图7a 的电化学阻抗图谱显示，在高频和中低频分别出现了一个容抗弧。高频区一般对应电极表面过程——非法拉第过程，其与生物矿化膜的电容和电阻有关。中低频区一般对应电化学过程，与电荷转移有关。可以发现，随着浸泡时间的延长，生物矿化膜在薄液膜溶液中的容抗弧逐渐变小。这个反应的等效拟合电路为Rs(QfRf)(QdlRct)，如图7b 所示。从阻抗拟合数据（表1）可以看出，矿化膜样品刚浸入液膜1 h 时，矿化膜在液膜中还未稳定，随着时间的延长，矿化膜的稳定性逐渐增强，因此膜电阻上升。继续浸泡，液膜中的氯离子和氧气慢慢渗入矿化膜，矿化膜防护性减弱，因此膜电阻和电荷转移电阻（Rct）逐渐减小。第1 天，Rf为2.3×104Ω·cm2，Rct为4870 Ω·cm2；第24 天，Rf为1.32×104Ω·cm2，Rct为695 Ω·cm2。电阻逐渐减小，说明生物矿化膜屏蔽效果在24 d 后逐渐下降，但是从扫描电镜图中可知，生物矿化膜在薄液膜下浸泡24 d 后，仍然具备较好的保护效果。第30 天，Rf为1.2×104Ω·cm2，Rct为731 Ω·cm2，与24 d 相比，Rf和Rct都有所下降，说明生物矿化膜在30 d 的防护效果减弱，与SEM 和FTIR 结果相符。

图7 生物矿化膜在液膜厚度为50 μm 时的EIS 和等效电路Fig.7 (a) Nyquist diagrams of the biomineralized film when the liquid film thickness is 50 μm and the (b) equivalent circuit diagram

表1 生物矿化膜在液膜厚度为50 μm 时EIS 随时间的拟合数据Tab.1 Fitting data of EIS over time for a biomineralized film with a liquid film thickness of 50 μm

2.3 生物矿化膜的宏观照片及其SKP 测试结果分析

图8 在薄液膜下浸泡1 h 及1、12、24、30 d 后样品的电位分布和宏观形貌Fig.8 Samples corresponding potential distribution and morphology of the biomineralized film after immersed in the thin liquid film for 1 h and 1, 12, 24, 30 d

形成生物矿化膜的样品在液膜厚度为50 μm 时浸泡不同时间后，生物矿化膜的形貌如图8 所示。由图8 可以看出，随着浸泡时间的增长，截止到24 d，在样品表面用肉眼并不能观察到明显的腐蚀产物。与样品实拍图所对应的SKP 结果显示，在盐雾试验进行到第12 d 时，生物矿化膜的伏打电位差是相近的，约为–0.16 V。根据伏打电位差Vkp与腐蚀金属电极的腐蚀电位Ecorr的线性关系Ecorr=Vkp+C得出，Vkp越大，Ecorr也就越大。此时负电位差较小，故腐蚀电位很低，不易发生腐蚀，这与电化学结果一致。电化学阻抗图中，1～12 d 的电化学阻抗值是相近的，说明生物矿化膜对金属起到了很好的保护作用，保护金属免受腐蚀介质的侵蚀。从12～24 d，样品表面的伏打电位差由–0.16 V 降低至–0.2 V，说明随着时间的增加，生物矿化膜的防护性能下降，但依然对金属有很好的保护效果。从24～30 d，生物矿化膜的伏打电位差由–0.2 V降低至–0.45 V，腐蚀电位也进一步负移。从第30 d的实拍图中可以看出，金属表面出现了肉眼可见的腐蚀产物。说明此时生物矿化膜中的部分有机物已经完全溶解，生物矿化膜已经出现了明显的缺陷，腐蚀介质通过缺陷到达了金属表面。缺陷处的金属基体作为腐蚀反应的阳极，阴极区发生氧还原反应，金属被腐蚀，此时生物矿化膜也就不再具有保护作用。

近年来，生物膜抑制腐蚀的作用引起了广泛的关注。微生物形成的生物膜可以抑制金属腐蚀过程，包括E.coil、Shewanella oneidensis、Bacillus spp.、Pseudomonas spp.、Pseudoalteromonas spp.和Vibrio neocaledonicus。然而，由于生物膜易于分散和溶解，生物膜防腐的持久性仍然是一个重要问题。在本研究中，通过钢样表面的形貌表征和腐蚀性能评价，证明了海洋细菌P. lipolytica菌株对样品具有抑制大气腐蚀的作用。这是因为，生物矿化膜的层次结构包括具有不同取向的细长棱柱状晶体，这种晶体有助于减少Cl–或O2的扩散。这种矿化膜一旦离开细菌环境，缺乏自我修复能力，随着在薄液膜下长时间的浸泡，矿化膜会发生一定程度的损害，这是后续研究中需要进一步改进的。

3 结论

1）P. lipolytica菌可在金属表面诱导形成生物矿化膜，该膜具有有机-无机杂化结构，其主要成分为方解石结构的碳酸钙镁盐。

2）带有生物矿化膜的低合金钢样品在50 μm 薄液膜下浸泡24 d，由于矿化膜的屏蔽作用，可以将金属与腐蚀介质隔离，因而得到良好的保护。

3）由宏观照片和SKP 的测试结果可知，生物矿化膜在前24 d 可以保护金属免受腐蚀介质的侵蚀，但在30 d 后，矿化膜表面出现了缺陷，伏打电位差变大，使得溶液中的氯离子可以渗入到金属表面，造成一定的腐蚀。