催产素的固相合成*

唐文力，李宜航

(常德职业技术学院，湖南 常德 415000)

催产素，又名缩宫素，是一种含有二硫键的环状九肽激素，在人类和哺乳动物的垂体后叶中释放，间接刺激子宫平滑肌收缩，模拟正常分娩的子宫收缩作用，导致子宫颈扩张，从而达到促进生产的功能，此外，催产素还可以刺激乳腺的平滑肌收缩，有助于乳汁自乳房排出，加快乳汁的分泌。所以催产素具有较高的药用价值和应用市场。

图1 催产素合成路线

目前催产素的制备方法主要是以哌啶为脱帽试剂的多肽固相合成法[1-2]，主要存在制备方法成本相对较高，并且不方便运输和储存的缺点。本研究采用以哌嗪作为脱帽试剂用Rink树脂合成片段，哌嗪不是易制毒试剂，成本比经典合成法用的易制毒试剂哌啶要低，并且更方便运输和储存，此外，Rink树脂合成片段还以方便自动化生产[3-8]；Rink树脂可以回收重复利用；适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应；降低了生产成本。合成工艺流程如图1所示。

1 仪器与试剂

Agilent technologies 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Milli--Q超纯水系统，德国默克密理博公司；R-100型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；GL-150干式恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；XW-80A旋涡混合器，上海精科实业有限公司。

Rink Amide-AM Resin(Rink树脂，替代度为0.48 mmol·g-1)，天津南开合成科技有限公司；所有氨基酸均采购自吉尔生化(上海)有限公司；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、二异丙基乙胺(DIEA)，均采购自苏州昊帆生物股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)、二乙胺、石油醚均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试剂配制

2.1.1 Kaiser试剂

a液①40 g苯酚溶于10 mL无水乙醇；②65 mgKCN 溶于100 mL水，取2 mL用吡啶(pyridine)稀释至100 mL。以10:100的比例混合①、②。

b液取2.5 g茚三酮溶于50 mL无水乙醇(需暗处保存)。

2.1.2 Fmoc-Ala-OH标准溶液

用电子天平精确称取Fmoc-Ala-OH 标准品15 mg放入15 mL的离心管中。用移液枪精确移取10 mL 5%的哌嗪溶液，并将其加入装有15 mg Fmoc-Ala-OH标准品的15 mL离心管中进行溶解，大约摇晃十 min后，配置成Fmoc-Ala-OH标准溶液。

2.1.3 脱保护溶液(5%哌嗪--DMF溶液)

5%哌嗪--DMF溶液：取25 g无水哌嗪溶于500 mL DMF中，配制成该溶液。

2.2 标准曲线的绘制

表1 不同浓度的Fmoc-Ala-OH溶液

取7支10 mL的离心管，并对其依次编号为1、2、3、4、5、6、7，取适量配置好的Fmoc-Ala-OH标准溶液与不同量的DMF溶液配置成浓度依次为0 μmol/L、0 μmol/L、19.28 μmol/L、38.56 μmol/L、57.84 μmol/L、77.12 μmol/L、96.40 μmol/L的混合溶液，放置待用，见表1。

用分光光度计测得各浓度混合液的吸光度，见图2。

图2 Fmoc-ALa-OH 溶液标准曲线

2.3 Gly-Rink 树脂的制备

称取1 g Rink Resin 于10 mL玻璃反应器中；加入约8 mL 20%哌嗪-DMF脱保护约20 min；抽去反应液，并用DMF洗涤2次、IPA洗涤3次、DMF洗涤4次。洗涤完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈蓝黑色。

取10 mL塑料管称取Fmoc-Gly-OH 约148 mg(依据为：树脂质量*取代率*氨基酸分子量*倍数)，HBTU约189 mg，并用2 mL DMF溶解，接着加入DIEA约132 μL，将溶解后的溶液倒入玻璃反应器中，涡旋5 min左右。将涡旋好的反应器放置于摇床上摇置2 h，中途每0.5 h旋转反应器一次。低压抽去反应液，并用DMF洗涤2次，IPA洗涤3次，DMF洗涤4次，取少许树脂滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈浅黄色。

量取200 mL脱帽试剂5%哌嗪-DMF溶液，倒入反应器中，反应20 min，然后抽去反应液，DMF洗涤4次，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈蓝黑色。

2.4 氨基酸与树脂结合率的测定

从“2.3 Rink 树脂和氨基酸相连”步骤中得到的“离心管(已标记)” 中，依次取出15 μL，10 μL溶液于10 mL离心管中，并用DMF溶液在离心管中定容到9 mL，然后用分光光度计依次测定所取溶液的吸光度，测得结果见表2。

表2 待测物吸光度

根据丙氨酸标准溶液C-Abs曲线，将A209nm (y)=带入0.56=0.0066x-0.0019，可以计算氨基的浓度(x)为85.13 μmol/L。进一步可算出取代率为0.39 mol/g。

2.5 Fmoc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-树脂的合成

得到Gly-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-Leu-OH 339 mg、缩合剂HBTU 364 mg和碱DIEA264 μL，溶剂为DMF，反应时间为2 h，反应完成后，用DMF洗涤4遍，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈无色，既反应完全。得到Fmoc-Leu-Gly-树脂后，量取200 mL脱帽试剂5%哌嗪-DMF溶液，倒入反应器中，反应20 min，抽去反应液，DMF洗涤4次，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈蓝黑色，既获得Leu-Gly-树脂。在获得Leu-Gly-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次Leu-Gly-树脂上连接氨基酸保护单体：Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH后得到：Fmoc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-树脂。

2.6 二硫键的形成

取300 mg粗产物，加入560 mg碘单质和1.5 mL DMF溶液，混匀加入反应瓶中。依次反应2 h，4 h，6 h成环。其中

碘单质的量=取代率/[(目的产物肽链分子质量×取代率) +树脂质量]

2.7 环肽的裂解

按照特定的氨基酸顺序合成完所需多肽后，就要把目标多肽从树脂上裂解下来，并进行进一步的分离纯化。

取环化后的粗品于反应器中，分三次加入约2 mL三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(TFA/TIS/H2O)=95/2.5/2.5(v/v)溶液，每次间隔20 min，收集滤液。向装有滤液的离心管中倒入约40 mL冷冻的无水乙醚，出现白色絮状沉淀，震荡并在6000 r/min，20 ℃条件下离心5 min，倒去溶剂乙醚，絮状物用氩气吹干沉淀。沉淀真空干燥24小时，固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体672 mg，-20 ℃保存。经计算，产率为89.99%。

2.8 丙氨瑞林粗品的分析

对催产素进行HPLC分析，色谱柱为Krosmail100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A相(0.1 M NaH2PO4/H2O)，洗脱液B(MeCN-H2O=1:1)；梯度洗脱：0～30 min；70%B～40%A，流速为1.0 mL/min，检测波长为215 nm，其纯度为97.68%，见图3。

图3 催产素色谱图

2.9 树脂回收

将树脂用DMF洗涤三次，甲醇洗涤三次，抽去滤液，真空干燥。另配置二氯亚砜的DCM溶液，加入装有树脂的固相合成反应器中，反应2 h后，抽去反应液，DCM洗涤。

3 结 论

催产素作为临床使用药物，现阶段对其药理活性研究较多，其合成研究相对较少。目前，在现有技术中，多采用液相合成方式，操作繁琐且副产物较多，此外，现有技术多采用哌啶作为脱帽试剂，该试剂为易制毒管制试剂，采购及运输较为困难。本研究采用固相合成方式，反应简单，纯度为97.68%，收率为89.99%，降低了生产成本，减少了副产物的生产。

本研究利用多肽固相合成法成功合成了催产素，该方法操作简单，Rink树脂合成片段可以方便自动化生产且成本较低，纯度高，反应条件温和，适合大规模工业化生产。