沙苑子中抗氧化活性物质的提取工艺研究

王 新，蒋彩云，李玲玲，刘海浪，冯鑫苇

(江苏经贸职业技术学院 健康学院，江苏 南京 211168)

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪的干燥成熟种子，主要含有沙苑子甙、沙苑子新甙、沙苑子杨梅甙、紫云英甙、山柰素，以及多肽、蛋白质、酚类等成分。作为传统中药，其性温味甘，归肝、肾经，具有温补肝肾、降压降脂、利尿涩精等功效[1-2]，可用于治疗肝肾亏虚、白浊带下、头晕目眩等症。

于猛等人通过计算机模拟的方法，初步探讨了沙苑子苷A潜在的抗肿瘤靶点，并采用CDOCKER进行分子对接初步验证。结果表明，沙苑子苷A可调控原癌基因酪氨酸蛋白激酶以及蛋白纤维生长的受体，从而进一步得出沙苑子苷A确实能够调控血管生长的相关靶点，可能是抗肿瘤作用的主要活性成分[3]。现代药理研究表明，沙苑子具有抗疲劳、延缓机体衰老等保健功能。同时，沙苑子及其复方制剂也可以通过增强细胞免疫和非特异性免疫的方式发挥抗炎、抗癌的功效[4-5]。研究发现，沙苑子的化学成分主要包括黄酮类、三萜皂苷类、脂肪酸、氨基酸、多糖等[6-7]。其中，沙苑子总黄酮具有较强的抗癌、抗氧化能力[8-9]，是沙苑子发挥药理作用的主要成分。

本文选用的标准参照物为维生素C，结合单因素考察法和正交试验法，分析沙苑子中抗氧化活性物质的提取工艺，并进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

沙苑子(安徽省亳州市双华中药饮片厂)、无水乙醇、1,3-丁二醇、甲醇、1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、维生素C，实验用水皆为去离子纯净水。

1.1.2 设备

HH-6数显恒温水浴锅：常州金坛宏华仪器厂；DR2800型紫外分光光度计：上海坤权生物科技有限公司；BS223S型电子天平：瑞士Mettler公司；电热鼓风干燥箱：华飞电热设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙苑子中活性成分的提取

称取沙苑子药材，放入烘箱烘干至恒重，放入粉碎机进行研磨粉碎，然后过筛。准备等体积的不同提取剂，分别称取沙苑子粉末1.0 g置于提取剂中，设定不同的提取条件，得到相应含沙苑子抗氧化成分的提取液。

1.2.2 DPPH法评价沙苑子提取液的抗氧化性

1.2.2.1 配制DPPH溶液

取39.0 mg 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，加入无水乙醇使其充分溶解，定容，配制浓度为0.1 mmoL/L 的DPPH溶液，将其移至棕色试剂瓶中，避光贮存，备用。

1.2.2.2 DPPH清除率的计算方法

空样溶液：取0.1 mmoL/L的DPPH溶液10 mL，加入比色管。

反应溶液：取5 mL沙苑子提取液和5 mL DPPH溶液，加入比色管。

空白溶液：取10 mL空白溶剂，加入比色管。

将上述溶液置于超声波中进行充分混合，避光反应半个小时。使用分光光度计，设定波长为517 nm，分别测定吸光度值(Abs)，即A空样液，A反应液，A空白液。

DPPH清除率(%)=[A空样液-(A反应液-A空白液)/A空样液]×100%

1.2.3 DPPH法评价维生素C的抗氧化性

1.2.3.1 配制维生素C标准溶液

取12.5 mg维生素C粉末，置于50 mL烧杯中，加入少量纯净水使其完全溶解，移至500 mL容量瓶中定容，配制成0.025 mg/mL的维生素C溶液。分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL维生素C溶液于10 mL比色管中逐级稀释，定容至10 mL。维生素C标准溶液的浓度分别为0.0015、0.0020、0.0025、0.0030、0.0035、0.0040、0.0045、0.0050 mg/mL。

1.2.3.2 制作维生素C标准曲线

按照1.2.2.2中的操作步骤，将反应溶液改为5 mL不同浓度的维生素C标准溶液，使用分光光度计，设定波长为517 nm，分别测定吸光度值，得出DPPH清除率的对应值。

1.2.4 每克沙苑子样品中抗氧化成分相当于维生素C的含量测定

取1.0 g沙苑子样品，在最佳提取条件下，测定所得提取液的DPPH清除率，再根据维生素C浓度与DPPH清除率的线性方程，计算每克沙苑子样品中含有的抗氧化成分相对于维生素C的当量。

2 结果与分析

2.1 维生素C标准溶液的抗氧化性

采用评价自由基清除效果和挑选天然抗氧化剂最常用的方法——DPPH分光光度法，测定已知标准浓度的维生素C的抗氧化性。以维生素C浓度为横坐标、DPPH清除率为纵坐标，建立标准曲线(见图1)。两者之间符合线性关系，得到线性方程y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)。根据线性方程，构建评价体系，测定单位沙苑子中抗氧化活性成分相对于维生素C的当量。

图1 VC浓度与DPPH清除率的标准曲线

2.2 因素水平的有效选择

2.2.1 提取溶剂对抗氧化物提取效果的影响

分别选用无水乙醇、75%乙醇、纯水、甲醇、1，3-丁二醇为提取溶剂，40 ℃加热，搅拌30 min，过滤，得到相应的提取液，计算各提取液的DPPH清除率。从图2可以看出，以75%乙醇为提取溶剂时，抗氧化物提取效果最佳，纯水次之。

图2 不同提取溶剂对DPPH清除率的影响

2.2.2 提取溶剂浓度对抗氧化物提取效果的影响

分别取浓度40%、50%、60%、70%、75%、80%的乙醇，40 ℃水浴加热30 min，抽滤，得到相应的提取液，测定提取液的抗氧化能力。从图3可以看出，50%乙醇的抗氧化物提取效果最佳。

图3 不同提取溶剂浓度对DPPH清除率的影响

2.2.3 料液比对抗氧化物提取效果的影响

选用50%乙醇，40 ℃条件下提取30 min，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，测定提取液的抗氧化能力。由图4可以看出，最佳料液比为1∶30。

图4 不同料液比对DPPH清除率的影响

2.2.4 提取温度对抗氧化物提取效果的影响

选用50%乙醇，提取温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃，提取时间30 min，测定提取液的抗氧化能力。从图5可以看出，DPPH清除率随温度升高而升高。但是实验过程中需要考虑温度过高容易导致溶剂量的损失及抗氧化物失活，因此，提取温度选定70 ℃。

图5 提取温度对DPPH清除率的影响

2.2.5 提取时间对抗氧化物提取效果的影响

选用50%乙醇，提取温度40 ℃，分别提取20、30、40、50、60 min，测定提取液的抗氧化能力。从图6可以看出，提取30 min时，DPPH清除效果最佳。

图6 不同提取时间对DPPH清除率的影响

2.3 正交试验设计

根据单因素实验结果，设计L20(44)正交试验，因素水平见表1，试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

从表2可知，各因素对沙苑子活性成分提取效果的影响顺序为料液比>提取温度>提取溶剂浓度>提取时间。得出最佳提取工艺条件：45%乙醇、料液比1∶32、提取温度70 ℃、提取时间30 min。

根据最佳提取工艺条件，精确量取1.0 g沙苑子粉末，加入32 mL 45%乙醇，70 ℃水浴加热，搅拌30 min，得到提取液，稀释后测定沙苑子提取物的DPPH清除率。平行实验三次，测定结果分别为：72.1%、73.0%、72.3%，得出抗氧化率的平均值为72.5%。

2.4 每克沙苑子样品中抗氧化成分相当于维生素C的含量

根据2.3最佳提取条件得到的平均抗氧化率为72.5%，由维生素C溶液与DPPH溶液的标准曲线方程：y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)，计算出单位质量沙苑子样品中抗氧化成分相当于维生素C的含量为46.2 mg。

3 结论

采用单因素实验结合正交试验的方法，考察提取溶剂浓度、提取温度、提取时间、料液比等因素对沙苑子中抗氧化活性物质提取效果的影响。选用维生素C作为标准参照物，对沙苑子中抗氧化活性物质提取工艺条件进行了优化。确定沙苑子中抗氧化活性物质的最佳提取工艺条件：料液比1∶32、提取温度70 ℃、提取溶剂45%乙醇、提取时间30 min。