SPR天然产物小分子抑制剂的“人工智能”药物筛选和“网络药理”作用机制研究＊

艾中柱，王皓南，周珊珊，江经纬，袁胜涛，黄必胜，杜鸿志＊＊

(1.湖北中医药大学药学院 武汉 430065；2.中药资源与中药化学湖北省重点实验室 武汉 430065；3.湖北中医药大学中医临床学院 武汉 430065；4.中国药科大学国家(南京)新药筛选中心 南京 210009)

近年来，针对肿瘤细胞代谢特征的靶向治疗，已成为肿瘤治疗新策略和研究热点，全球医药巨头都聚焦于抗肿瘤代谢药物研发[1]。正如，四氢生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin：BH4)是肿瘤细胞代谢的关键物质，在肿瘤的发生发展中起到重要作用，通过调控肿瘤细胞BH4代谢可能是潜在治疗策略[2]。其中，墨蝶呤还原酶(Sepiapterin reductase：SPR)是BH4合成的重要关键酶。1989年PNAS杂志首次报道称，SPR抑制剂能够抑制鼠源红白血病细胞的增殖[3]；随后，NIMH(美国国家心理健康研究所)的Kaufman课题组进一步确证了这一作用[4]。2015年，美国密西根大学的Bachmann课题组通过临床数据分析表明，在神经母细胞瘤中SPR的表达与肿瘤的恶性程度以及一些神经母细胞瘤相关肿瘤基因的表达呈正相关，而SPR抑制剂可以抑制神经母细胞瘤细胞的增殖[5]。同样地，Nature杂志2018年报道证实了SPR抑制剂能够显著地抑制细胞的增殖[6]。最新，本团队首次证实SPR能促进肝癌细胞增殖，其表达与肝癌患者的不良预后密切相关[7]；同时，也发现SPR在结直肠癌组织中显著高表达，研究证实SPR通过调控结直肠癌细胞增殖和转移，从而促进结直肠癌恶性进展。总之，SPR可能作为多种肿瘤不良预后的潜在指标，是潜在的抗肿瘤新靶点。因此，本研究拟筛选SPR的小分子抑制剂，以期为肿瘤治疗提供可能的治疗新方案。

天然产物，毫无疑问是药物开发的宝库。2020年美国国立卫生研究院(NIH)发表题为“Natural Products As Sources of New Drugs”的综述指出近四十年间所有上市的抗肿瘤药物，大约50%的药物是天然产物或衍生于天然产物[8]。目前，已发现数万的天然小分子化合物，不少报道具有抗肿瘤活性。为此，我们拟筛选SPR天然产物小分子抑制剂。传统上，筛选靶点的小分子抑制剂，需花费大量资金获得实体药物后，先逐一进行酶学水平筛选，随后进行体内外验证。这种药物筛选过程，存在耗时长、成本高、效率低等问题。于是，越来越多的研究机构开始采用“人工智能”药物设计筛选体系[9]，将基于机器学习技术来模拟小分子化合物的药物特性，从而挑选出最有希望的模拟化合物进行合成和实验。2019年7月，全球首个基于“人工智能”获得的药物问世，并批准进入临床试验阶段[10]。今年，新型冠状病毒肺炎席卷全球，我国科学家在极短的时间内基于“人工智能”筛选出一批候选药物，这为它们成功地应用于临床提供了有力的科学支撑，其中，多个天然化合物也被筛选为候选药物[11]。可见，“人工智能”药物筛选，将有助于天然产物的有效开发利用。然而，天然产物的药理作用机制往往具有“多层次、多途径、多靶点”的特性，这给它们开发研究增加了巨大的困难。2007年，英国药理学家Hopkins首次提出“网络药理学”的概念[12]。它是指通过生物学网络中节点的连接和关系来分析网络特性，从而阐明药物作用机制。“网络药理学”与天然产物的药理作用机制复杂的特点不谋而合，在天然产物的作用机制研究中大量应用，已成为当前的研究热点[13]。今年，在中医药抗击新型冠状病毒肺炎中，“网络药理学”为诸多中药的临床应用及时地提供了一定的科学支撑[14-16]。所以，“网络药理学”符合天然产物药理作用机制的特性，将为其机制研究指明方向，提高研究效率。

因此，我们将针对SPR开展天然产物小分子抑制剂的筛选研究，拟通过“人工智能”药物筛选，从成千上万个天然产物中获得数十个最佳候选小分子(图1)。同时，针对SPR候选的天然产物小分子抑制剂，借助“网络药理学”对天然化合物、作用靶点和不同途径的相互作用网络进行分析研究，以期初步阐明其抗肿瘤作用机制，为后续体内外机制探究，指明了方向。总之，本团队依托“墨蝶呤还原酶促进结直肠癌进展的作用机制及其抑制剂发现的研究”项目为SPR天然产物小分子抑制剂的研究，奠定了一定的工作基础。这将为后续深入开展酶学、细胞水平和动物水平的评价减少了盲目性，极大降低研发成本和工作量，有望提高研发效率，还能为天然产物小分子抑制剂的研究开发提供启示。

图1 研究方法思路图

1 材料与方法

1.1 天然产物小分子数据库的建立

搜集中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Selleck Chemicals天然产物库(https://www.selleck.cn/)、Med Chem Express天然产物库(https://www.medchemexpress.cn/)和Target Mol天然产物库(https://www.tsbiochem.com)等平台的天然小分子化合物。下载化合物的三维结构，建立用于“人工智能”药物筛选的天然产物小分子数据库。应用openbabel(版本号2.4.1)软件将全部天然产物单体分子(MOL2格式)转换成pdbqt格式用于分子对接。

1.2 “人工智能”药物虚拟筛选方法

SPR的晶体结构从RCSB蛋白数据库(PDB ID：4z3k)下载。去除晶体结构内的小分子结构和结晶水分子，转换成pdbqt格式，然后将分子对接空间最大化。以此SPR蛋白胞结构与天然产物小分子结构进行分子对接(Autodock vina对接软件(版本号4.2))，选择结合自由能小于-14kcal/mol的天然产物小分子，以“三重积分协同过滤计分系统”(人工智能筛选系统)判断天然产物小分子的结合位置，计算位置分数较高的候选天然产物若干个。

其中，“人工智能”药物设计筛选体系，将基于机器学习技术来模拟小分子化合物的药物特性，比如靶点结合能力和特异性，药物动力学和药物代谢特性，以及毒副作用，从而挑选出最有希望的模拟化合物进行合成和实验，提高筛选效率，从而节省时间和金钱。本研究中用到的“三重积分协同过滤计分系统”(人工智能筛选系统)由国家南京新药筛选中心(中国药科大学)江经纬副研究员基于“协同过滤算法(collaborative filtering)”自行编程设计，详见团队已发表文章[17]。协同过滤算法是对小分子抑制剂行为数据的挖掘，发现抑制剂的偏好，基于不同的偏好对抑制剂进行群组划分并推荐行为相似的候选抑制剂的著名推荐算。利用该系统，团队已经成功筛选出PD-1/PD-L1的小分子抑制剂[18]、p53变构剂[19]和VSIG3小分子抑制剂[20]等多个候选的药物，并成功获得或申报了国家专利。

1.3 化合物-靶点网络的构建

根据“人工智能”药物筛选得到1783个候选小分子化合物，综合考虑结合能，口服生物利用度(OB)(大于20%)，类药性(DL)(大于0.7)和文献报道等指标，选择最佳化合物基于SwissTargetPrediction数据库(SIB，http://www.swisstargetprediction.ch)和STITCH数据库(http://stitch.embl.de)等获得其潜在靶点，将Probability在0.3及以上的243个靶点作为其候选的作用靶蛋白。随后，将这些筛选出的作用靶蛋白通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)规范其名称，再将规范后的靶点导入STRING(https://string-db.org/)数据库，就可以获得“化合物-靶点”相互作用信息。接下来，下载互作信息文件导入Cytoscape软件(版本号3.6.0)，在软件Network Analyzer插件里即可进行药理作用机制网络分析，筛选degree大于2的100个蛋白作为其关键靶点。最后，在Cytoscape软件中构建化合物-靶点的网络机制图。

1.4 靶点富集分析

在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)中，选择人源靶点，导入上述筛选的靶点信息，进行KEGG信号通路分析和GO富集分析。最后，将分析的数据整理后，即可利用R语言和Cytoscape软件对网络进行可视化。

2 研究结果

2.1 SPR天然产物小分子抑制剂“人工智能”药物筛选模型的建立

首先选择SPR的原底物墨蝶呤和已报道的抑制剂(吲哚美辛(Indomethacin，Indocin)、芦丁(Rutin)、磺胺吡啶(Sulfapyridine，SFD)和磺胺噻唑(Sulfathiazole，SFZ))进行了“人工智能药”物筛选模型测试。结果显示，其最优结合能在-8.0 kcal·mol-1左右。它们与SPR蛋白结构的作用位点和相互作用模式见表1和图2。下一步，利用该“人工智能”药物筛选模型，进行SPR天然产物小分子抑制剂虚拟筛选。

图2 原配体和已报道阳性药物与SPR的对接模式

表1 原配体和阳性药物与SPR的对接数据

2.2 SPR天然产物小分子抑制剂“人工智能”药物筛选结果

首先，经过“人工智能”虚拟筛选，共有1783个天然小分子化合物的最优结合能小于原配体和阳性抑制剂(-8.0 kcal·mol-1左右)，表明这些化合物与SPR结合能力较强。然后，选择结合自由能小于-14 kcal·mol-1的天然产物小分子，以“三重积分协同过滤计分系统”(人工智能计分系统)判断天然产物小分子的结合位置，筛选出位置分数较高的20个候选天然产物小分子化合物(图3)。这些化合物的分子量在400-500左右，主要是三萜和甾体类。其中，预测活性最强的6个天然小分子化合物最优结合能均小于-17 kcal·mol-1，类药性(DL)均远大于0.18这个常用阈值(表2)。预测活性最强的是山楂酸(Maslinic acid)，结合能为-18.4 kcal·mol-1，结合位点是ARG14，GLY15，PHE16，GLY17，ASN97，ILE152，PRO195，GLY196，PRO197，LEU198，THR200，MET202，GLN203(图4)。山楂酸在大枣、覆盆子、金樱子和枇杷叶等常见中药材的主要活性成分之一。其次是刺囊酸(Echinocystic acid)，它的 结 合 能 是-18.2 kcal·mol-1，结 合 位 点 是GLY11，ARG14，GLY15，PHE16，GLY17，ASN97，ILE152，SER153，PRO195，GLY196，LEU198，THR200，ASP201，MET202(图4)，它在紫菀、大皂荚、墨旱莲、皂角刺和猪牙皂等药用植物中均有发现。此外还有常见草药雷公藤中的雷公藤红素(Celastrol)、积雪草中的羟基积雪草酸(Madecassic acid)和积雪草酸(Asiatic acid)以及莪术中的常春藤皂苷元(Hederagenin)等活性成分，也具有较强的SPR抑制作用。总之，这些天然产物可能是SPR的有效小分子抑制剂。

图4 预测活性最强的前6个SPR天然产物小分子抑制剂与酶的对接模式

表2 预测活性最强的前6个SPR天然产物小分子抑制剂与SPR的对接数据

图3 预测活性最强的前20个SPR天然产物小分子抑制剂

2.3 SPR天然小分子抑制剂，刺囊酸的抗肿瘤网络作用机制

基于上述“人工智能”药物筛选和“计算机分子对接”，筛选出SPR的最佳潜在天然小分子抑制剂可能是山楂酸、刺囊酸、雷公藤红素、羟基积雪草酸、积雪草酸和常春藤皂苷元等天然产物。综合考虑结合能量、口服生物利用度(OB)和类药性(DL)等指标，下一步我们将重点评价三个筛选指标均最高的刺囊酸的抗肿瘤作用，并探究其抗肿瘤作用机制。因此，我们对刺囊酸展开了“网络药理学”作用机制探索研究，以期为后续研究指明方向。

2.3.1 刺囊酸靶点-靶点网络图构建

将刺囊酸得到的相关靶点100个，导入STRING数据库中，得到PPI网络关系图。PPI中有边(edge)418条，节点(node)97个，平均度(degree)值8.62。将相关靶点导入Cytoscape软件中，构建PPI图(图5)。网络中节点由蓝色向红色转变表示靶点相关性成正比，网络节点的度表示网络中和节点关联的边的数目。连接靶点较多的节点在整个网络中起到可能为枢纽蛋白。结果显示刺囊酸前5个关键靶点可能是SRC(rous sarcoma oncogene，劳斯肉瘤癌基因)(node：SRC；degree：45；Betweenness Centrality：0.202)，ESR1(estrogen receptor 1，雌 激 素 受 体1)(node：ESR1；degree：35；Betweenness Centrality：0.095)，PPARA(peroxisome proliferator activated receptor alpha过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ)，(node：PPARA；degree：31；Betweenness Centrality：0.125)，TP53(tumor protein p53，肿瘤抑制蛋白53)，(node：TP53；degree：30；Betweenness Centrality：0.0702)，PPARG(peroxisome proliferator activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖物激活受体γ)，(node：PPARG；degree：29；Betweenness Centrality：0.01)。

图5 刺囊酸的靶点-靶点网络图(PPI)

2.3.2 刺囊酸相关靶点的富集分析

2.3.2.1 GO富集分析

将得到的靶点导入DAVID数据库中，进行GO富集分析，富集分析结果包含3个部分，分别为生物学过程(Biological Process，BP)(94个基因)、细胞组成(Cellular Component，CC)(95个基因)和分子功能(Molecular Function，MF)(95个基因)。以P＜0.05为阈值，采用Count值排序，分别筛选出前10个条目，绘制气泡图。见图6，其中纵坐标为GO条目名称，横坐标和气泡大小为相关基因数Count值，颜色以-log10(PValue)代表。富集结果表明刺囊酸可能涉及到的生物学过程(Biological Process，BP)主要有RNA聚合酶II启动子的转录起始(transcription initiation from RNA polymerase IIpromoter)，细胞增殖的调控(regulation of cell proliferation)和G蛋白偶联受体信号途径(G-protein coupled receptor signaling pathway)等(图6A)。涉及细胞组成(Cellular Component，CC)主要有质膜(plasma membrane)，膜的组分(integral component of membrane)和胞浆(cytosol)等(图6B)。涉及分子功能(Molecular Function，MF)主要有蛋白结合(protein binding)，锌离子结合(zinc ion binding)和类固醇激素受体(steroid hormone receptor activity)等(图6C)。

2.3.2.2 KEGG富集分析

将得到的靶点导入DAVID数据库中，进行KEGG富集分析，以P＜0.05为阈值，采用Count值排序，分别筛选出前10个条目，绘制气泡图。其中纵坐标为信号通路名称，横坐标和气泡大小为相关基因数Count值，颜色以-log10(PValue)代表。富集结果表明，刺囊酸涉及多条与肿瘤相关的信号通路。包括癌症信号通路(Pathways in cancer，Count：19)，癌症中的蛋白多糖信号通路(Proteoglycans in cancer，Count：9)和PPAR信号通路(PPARsignaling pathway，Count：9)等(图6D)。

3 讨论

天然药物来源于动物、植物、微生物和矿物，尤其以植物来源为主。自古至今，天然产物在人类与疾病斗争的过程中，发挥了巨大的作用。先后有吗啡、阿司匹林、喜树碱、紫杉醇和青蒿素等药物被批准应用，它们直接来源于植物或衍生于植物药[8]。近年来，美国食品药品监督管理局继续批准了巨大戟醇甲基丁烯酸酯、高三尖杉酯碱和Crofelemer等天然药物应用于临床[8]。目前，已发现的天然药物多达数万，不少报道具有广泛的药理活性。然而，绝大部分化合物靶点未知，作用机制不明确，严重阻碍它们有效地开发利用。

本团队基于前期文献调研和实验证实，SPR可作为白血病、胶质瘤、肝癌和肠癌等多种肿瘤不良预后的指标，是新的抗肿瘤靶点[2]。为此，我们拟针对SPR，开发天然产物小分子抑制剂。首先，我们整合多个平台数据，构建了天然产物小分子虚拟数据库。随后，通过“人工智能筛选”在短时间内就从成千上万个化合物中，成功筛选出了20个最佳的候选天然产物小分子抑制剂。进一步地，重点考察了山楂酸、刺囊酸、雷公藤红素、羟基积雪草酸、积雪草酸和常春藤皂苷元等6个天然产物，结果显示它们的结合均能远低于已报道的抑制剂，而且类药性也远大于常用阈值，显然它们将是SPR抑制剂开发的重点研究对象之一。因此，“人工智能”SPR天然小分子抑制剂的筛选，能极大缩小了候选化合物的筛选范围，有望提高研发效率和成功率。

基于“人工智能”药物筛选的结果，我们又综合考虑结合能量、口服生物利用度和类药性等指标，进一步地选取次囊酸作为研究对象，开展网络药理学分析。利用数据库得到次囊酸相关靶点100个，构建靶点-靶点图(PPI)，根据关键靶点排序中发现多个靶点均与肿瘤有相关性。已有研究表明，SRC是受体结合后激活的主要激酶之一，在其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)家族的激活中起作用，SRC激酶在一些肿瘤组织和肿瘤细胞系如结肠癌细胞中的活性增加[20]。TP53在许多肿瘤类型中起抑癌作用，根据生理环境和细胞类型诱导生长停滞或凋亡，TP53在大约60%的癌症中经常发生突变或失活，与癌症具有很强的相关性[21]。对次囊酸关键靶点富集分析，GO富集分析发现，次囊酸可能对RNA聚合酶II启动子的转录起始，细胞增殖的调控和G蛋白偶联受体信号途径起调节作用，这些生物学过程通过影响诸多信号通路的传导，控制肿瘤细胞中基因的转录和翻译，从而调控蛋白质的合成与稳定性，最终调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列的生理病理过程。进一步KEGG富集分析发现，排在第一位的是肿瘤信号通路(Pathways in cancer)，还涉及到癌症中的蛋白多糖信号通路(Proteoglycans in cancer)等。由富集结果表明，次囊酸可能通过干预多条与肿瘤相关的通路，从而发挥抗肿瘤作用。

因此，本研究一方面通过“人工智能”药物筛选，获得了山楂酸、刺囊酸、雷公藤红素、羟基积雪草酸、积雪草酸和常春藤皂苷元等数个候选的SPR天然产物小分子抑制剂。另一方面，基于“网络药理学”研究，揭示了代表SPR抑制剂刺囊酸的药理作用机制。虽然，“人工智能”药物筛选和“网络药理”作用机制研究，只能初步地筛选出候选药物和揭示其作用机制，还需要进一步地借助细胞分子生物学、动物实验和临床试验进行确证。但是，这些结果有望为后续SPR抑制剂的筛选评价，缩小筛选范围，极大地提高成功率；同时，还可能为候选药物的作用机制探究，明确方向，显著提高研究效率。总之，本研究期望为天然产物小分子抑制剂的研究开发，提供思考和启示。