基于网络药理学的藏药二十五味肺病丸防治新冠病毒肺炎（COVID-19）可行性分析及机制探讨＊

李晓朋，史志龙，龚普阳，哈立洋，李彦希，谭 睿，顾 健＊＊

(1.西南民族大学药学院 成都 610041；2.西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031)

2019年12月以来，由于新型冠状病毒(SARSCoV-2)导致的急性肺炎(COVID-19)在全世界开始流行，国外如意大利、西班牙、美国、法国等[1]。至2020年3月24日，国外仅意大利，西班牙、美国、法国就分别有63927、35136、46376、16018确诊病例，国外累计确诊病例为307314，并且呈现出快速增长趋势。我国累计确诊病例为81803，目前疫情基本得到控制，病例主要以境外输入为主。此次病毒主要靠呼吸道飞沫进行传播，还可以通过接触传播，具有传播能力迅速并且传染性强的特点。SARS-CoV-2是目前发现的一种新的冠状病毒，目前我们对这种全新的病毒的认识还不全面，目前主要采用中医和西医进行相关治疗，目前无特效治疗药物[2]。COVID-19属于急性感染性肺炎，感染者最初主要表现为呼吸道症状、咳嗽、发热和呼吸困难等，在较严重病例中可能引起肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，严重的话还会导致死亡[3]。2020年1月30日，WHO宣布将新型冠状病毒肺炎(novel coronavirus pneumonia，NCP)疫情列为国际关注的突发公共卫生事件[4]，找到治疗新冠肺炎新的治疗方法极为重要，迫在眉睫。

藏医药是我国民族医药的珍宝，它是仅次于中医药的一门民族医药。在经历了漫长发展过程中，藏族人民通过与自然和疾病的较量后逐步累积和掌握了治疗各种疾病的方法，形成了自己独特的治病风格；在吸收了中医药学、希腊医药学、印度医药学等医药精华的基础上，创造了自身的理论体系[5]。由病毒导致的传染病多属于我国传统医学古代“瘟疫”的范畴[6]。对于瘟病而言，藏医通常称为瘟热病，是人们感受秽气、浊气后导致的一种急性传染病。瘟病发病的病因分为内因和外因，内因是赤巴邪，外因是四季气候异常，环境的五元发生不足、过盛，剧烈运动，饮食问题，或受到惊吓或悲伤，尤其是接触或吸入具有的秽气毒风，瘟邪通过汗孔、鼻孔及人体六门，依次进入培根、赤巴、隆所存在的部位而发病[7]。四味藏木香汤散是医治瘟热病的基础药，主要成分为藏木香，悬钩木，宽筋藤和干姜[8]。从首例新冠病毒肺炎逝者尸体解剖报告来看，病毒主要引起深部气道和肺泡损伤为特征的炎症反应，与SARS的病理特征非常相似，病变主要还是集中在肺部[9]。肺内感染是由致病菌或病毒感染造成的肺部疾患，包括西医的急、慢性支气管炎、气管炎、急、慢性肺炎等上呼吸道感染疾病，属中医咳嗽、痰饮、肺痈、哮喘等范畴。选用藏药二十五味肺病丸加味治疗肺内感染150例，疗效较好，总有效率为99.9%[10]。二十五味肺病丸包含四味藏木香汤散中除干姜中的3味药，由檀香、悬钩木、藏木香、石灰华、红花、獐牙菜、沙棘膏、诃子、宽筋藤等25味药材组成，具有清热解毒、抗炎、抗病毒、止咳化痰等药理作用，主要功能为清热消炎、止咳，同时可以消除肺部相关炎症，清热解毒，止咳化痰，对于新型冠状病毒引起的肺炎可能具有一定的防治作用。

随着系统生物学和生物信息学等前沿科技的进步、生物医药领域数据的迅增以及计算能力与实验手段的快速进步，中药方剂的研究已突破单生物学因素和单纯实验手段的限制，使得从“关系—网络—功能”的角度探索中药方剂的特色内涵成为可能[11]。网络药理学是通过系统生物学的理论对生物系统的网络分析，选取需要的信号节点进行多靶点药物分子设计一门学科。网络药理学强调对信号通路的多途径调节从而增强药物的治疗效果，降低药物的毒副作用[12,13]。本研究拟通过网络药理学筛选二十五味肺病丸作用靶点，初步探究二十五味肺病丸关键化合物，由于本文研究基础药为藏药大复方，大部分化学成分在数据库中检索不到，只有通过文献挖掘，查询各药材的特征化合物，再结合Chemical book数据库以及TCMSP数据库进行验证以保证化学成分结构准确性，局限性可能由于藏药数据库不完善，导致本文章所研究的化合物可能不全面，但是本文章选择的化合物为各药材特征性化合物，具有一定的代表性。通过CTD数据库查询COVID-19作用靶点，找到与二十五味肺病丸共有靶点进行蛋白互作以及GO富集分析和KEGG富集分析来探讨二十五味肺病丸防治COVID-19作用机制，为二十五味肺病丸防治新冠病毒肺炎提供相应依据。

1 方法

1.1 二十五味肺病丸中成分收集

由于二十五味肺病丸藏药组方复杂，其组成成分大多数在中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/)检索不到，因此根据药材中化合物的专属性、类药性(分子量、生物利用率、口服吸收等参数)以及药理活性的相关文献报道并结合Chemical book数据库(https://www.chemicalbook.com/)和TCMSP数据库进行确认，确定目标化合物，下载其3D结构并保存为.mol格式。

1.2 目标化合物作用靶点预测

Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)是一种小分子作用靶点预测的数据库，可以预测小分子化合物的作用靶点，同时给出Uniprot ID及其他化合物相关信息，将得到的目标化合物的三维结构文件导入Swiss Target Prediction数据库，设置属性为“Homo sapiens”预测活性成分靶点，并以.csv格式下载文件，筛选(可能性大于5%)靶点蛋白。

1.3 药材-化合物-靶点构建

将以上收集到的数据制成药物-化合物和化合物-靶点的Excel表，将其导入Cytoscape软件中，点击Tools中的Merge键将两个网络整合在一起，构建药材-化合物-靶标网络，分析化合物和靶点网络。

1.4 COVID-19与二十五味肺病丸共同靶点基因收集及蛋白互作网络的构建

运用CTD数据库(http://ctd.mdibl.org/)查询与COVID-19疾病相关的靶点基因，通过分析找出与二十五味肺病丸共有的靶点基因并构建化合物-共有靶点-疾病网络图进行可视化。将共同基因导入STRING(http：//string-db.org)数据库中进行蛋白互作分析，以minimum required interaction score为0.4作为筛查标准，选取置信度较高的数据，构建由导入基因所表达产物组成的PPI网络图。

1.5 靶点的通路分析

为了进一步分析靶标蛋白基因的功能以及在信号通路中的作用，将以上筛选得到的二十五味肺病丸与COVID-19共同靶点靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，限定物种为人，进行GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析，将数据下载。运用作图软件绘制GO富集条形图和KEGG通路气泡图。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

根据药材中化合物的专属性、类药性并通过TCMSP检索到檀香、悬钩木、山柰、红花、獐牙菜、甘草、藏木香、宽筋藤等19种药材化合物共38个，收集其MOL ID以及OB%值和DL值(没有MOL ID的用CAS号代替)，OB值越高通常表示药物的生物活性越好和类药性(DL)越好，具体见基本信息见表1。

表1 二十五味肺病丸化合物基本信息表

2.2 药材-化合物-靶点网络

药材-化合物-靶点网络由1475条边和476个节点，包含了19种药材，38个化合物和相应靶点419个(图1)，靶点基因在图中用绿色的方框表示，化合物在图中用蓝色的圆圈表示，药物在图中用红色的三角表示(颜色深的表示其在网络中作用越大)。在图中每条边代表药材与化合物及化合物与靶点相互作用关系。在网络中，1个节点的度值表示网络中和节点相连的路线的条数。对网络图进行网络拓扑分析，这些连接化合物或靶点较多的节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或者靶点。在网络图中，许多化合物有相同的作用靶点，同时也有相应的靶点作用于不同的化合物，因此二十五味肺病丸中存在1个化合物与多个靶点作用，同时也存在不同化合物共同作用于同1个靶点的现象。有50%的化合物作用靶点大于20个，有31.5%的化合物作用靶点超过12个。排名靠前的化合物可能为二十五味肺病丸中关键化合物，排名前10的化合物分别为MOL000422-山柰酚(Kaempferol)、MOL000098-槲皮素(Quercetin)、MOL000354-异鼠李素(Isorhamnetin)、MOL002083-苜蓿 素(Tricin)、MOL000008-芹 菜 素(Apigenin)、MOL004804-甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、MOL010601-科罗索酸(Corosolic acid)、MOL005559-山楂酸(Maslinic acid)、MOL001996-路路通酸(Betulonic acid)、MOL001002-鞣花酸(Ellagic acid)。从靶点角度而言，由于筛选的为特征性化合物，化合物数量较小导致靶点节点差异性较小，因此选出排名前30的靶点为CA12、CA2、CA7、CA1、CA9、MMP2、CA14、CYP19A1、ADORA2A、AKR1B1、AKR1B10、CA13、ADORA1、ESR2、TERT、ALOX5、CA4、TOP1、PTPN1、AR、ADORA3、CA6、BACE1、CA5A、CA3、MMP3、PTGS2、EGFR、ESR1、AKT1。结合肺病相关通路的靶点蛋白，初步筛选出可能潜在的关键靶点为PTGS2、AR、ESR1、AKT1、EGFR。

图1 二十五味肺病丸药材-化合物-靶点网络

2.3 COVID-19与二十五味肺病丸共同靶点基因及蛋白互作网络

运用CTD数据库(http://ctd.mdibl.org/)查询与COVID-19疾病相关的靶点基因472个，与二十五味肺病丸共有靶点基因77个，分别为ESR1、NOS2、PPARG、PTGS2、PPARA、HMGCR、CYP17A1、NR1H4、TLR9等(图2)。对化合物-共同靶点-疾病网络进行可视化见图3，该网络图中，绿色代表疾病，蓝色代表共有靶点，粉色代表化合物。该网络中共有112个节点，330条边，包含了1个疾病、35个化合物和相应靶点77个。将共有靶点输入到String数据库中进行检索，选取minimum required interaction score＞0.4的靶点，进行PPI网络分析(图4)，其中各节点代表靶点基因，每条边代表靶点与靶点之间的相互作用关系，该网络中含有77个节点，891条边，平均每个节点有23.1条边，颜色越深，节点的度值越大(图4)，说明该节点发挥的作用就越大，作用机制就越复杂。筛选度值排名前30的靶点分别为AKT1、IL6、CASP3、MAPK3、TNF、SRC、EGFR、JUN、MAPK1等，具体信息见图5，这说明二十五味肺病丸相关靶点是通过复杂的相互作用关系对COVID-19起到相应的防治作用。另外在2.2中分析的关键靶点PTGS2、AR、ESR1、AKT1、EGFR除AR外皆在图5中，这也充分验证了2.2分析的可靠性。

图2 二十五味肺病丸与COVID-19共有靶点基因图

图3 化合物-共同靶点-疾病网络图

图4 二十五味肺病丸蛋白互作PPI网络模型图

图5 PPI网络中的关键节点

2.4 靶点通路分析

通过DAVID数据库进行的GO功能富集分析得到339条生物过程条目(BP)，45条细胞组成条目(CC)和81条分子功能条目(MF)结果见图6。KEGG通路富集分析筛选得到102条信号通路。信号通路中包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、甲型流感、胰腺癌、T细胞受体信号通路等。其中小细胞肺癌通路有AKT1、PTGS2、BCL2L1、NOS2、IKBKB等靶点基因，非小 细 胞 癌 通 路 有AKT1、EGFR、PRKCA、MAPK1、ERBB2等靶点基因，膀胱癌通路有EGFR、MAPK1、MMP9、ERBB2、MAPK3等靶点基因，甲型流感作用通路有AKT1、MAPK1、IL6、TNF、JUN等靶点基因，胰腺癌通路有AKT1、EGFR、MAPK1、ERBB2、MAPK3等靶点基因、T细胞受体信号通路有AKT1、MAPK1、TNF、JUN、GSK3B等靶点基因。选P值较小的25个通路进行可视化(图7)。

图6 二十五味肺病丸靶标的GO富集分析

图7 二十五味肺病丸作用靶点KEGG富集分析的25条通路气泡图

3 讨论

从COVID-19爆发至今，给广大人民群众健康造成的严重的威胁。藏医药作为我国医药学中仅次于中医药的一门民族医药，在藏族人民长期与疾病斗争中累积和掌握了丰富的自我保健及治疗各种疾病的方法。本研究以藏药二十五味肺病丸为基础，主要是通过查阅文献中该药物药材的特征性化合物成分从而进行了相关分析，利用网络药理学的方法探讨藏药二十五味肺病丸防治COVID-19的可行性分析，从而为二十五味肺病丸防治COVID-19提供相应依据，同时老药新用可以减少新药研究临床试验所耗费的时间，为早日战胜疫情提供相应的帮助。

本研究采用网络药理学方法对二十五味肺病丸组方药材檀香、悬钩木、藏木香、红花、獐牙菜、沙棘膏、诃子、宽筋藤等化合物及靶标进行网络分析，从网络药理学分析结果可知山柰酚(Kaempferol)，槲皮素(Quercetin)、异鼠李素(Isorhamnetin)、苜蓿素(Tricin)、芹菜素(Apigenin)、甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、科罗索酸(Corosolic acid)、山楂酸(Maslinic acid)、路路通酸(Betulonic acid)、鞣花酸(Ellagic acid)等化合物可能为二十五味肺病丸中的关键化合物，可能对COVID-19防治起到一定作用。有文献研究表明山柰酚对急性肺损伤[14]、乳腺炎[15]、关节炎[16]等炎症疾病可能有潜在的治疗效果。槲皮素作为一种自然界天然存在的黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，其抗炎作用主要通过抑制炎症因子的表达产生抗炎效果[17]。异鼠李素作为黄酮类化合物，具有抗炎，抗病毒等多种作用[18]。苜蓿素(Tricin)为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用[19]。芹菜素为黄酮类化合物，具有抗病毒、抗真菌、减肥、抗寄生虫、免疫调节等作用[20]。甘草次酸为五环三萜类化合物，具有抗炎、抗免疫等作用[21]。科罗索酸为五环三萜类化合物，具有抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗氧化等作用[22]。山楂酸为五环三萜化合物，具有抗肿瘤、降糖、抗菌、抗炎、神经保护等作用[23]。路路通酸具有抗炎镇痛等作用[24]。鞣花酸为多酚二内酯化合物，具有抗氧化功能、抗癌、抗突变性能等作用[25]。通过分析可知，排名靠前的关键化合物多数为黄酮类化合物和五环三萜类化合物，具有抗炎，抗病毒的作用，可能对于COVID-19具有一定的防治作用。通过对药材-化合物-靶点网络和COVID-19靶点与二十五味肺病丸共同靶点的蛋白互作分析可知初步筛选出可能潜在的关键靶点PTGS2、ESR1、AKT1、EGFR等，二十五味肺病丸可能作用于以上关键靶点并通过靶点蛋白之间的相互作用对COVID-19起到一定的防治作用，此外通过通路富集分析，得出与肺相关的疾病通路、炎症、免疫相关通路，二十五味肺病丸可能作用于以上通路，对COVID-19起到一定的防治作用，但具体情况还有待进一步研究。

自疫情爆发以来，中医药成为治疗COVID-19的重要力量，与此同时寻找其他的治疗方式也极为重要，本研究以藏药二十五味肺病丸为研究基础，探讨二十五味肺病丸防治COVID-19的可行性和机制探讨，发挥藏医药在防治COVID-19过程中起到的相应作用，藏医药同样是祖国医学宝库中的瑰宝，在我国医药学中是仅次于中医药的一门民族医药，另外本研究有利于促进探寻通过藏医药防治COVID-19的方法，为早日战胜疫情提供相应的帮助。