不同预处理方法对检测食醋中丁酸含量的影响

刘青，田慧敏，邱一秀 ，朱立磊，宋元达

(1.山东理工大学 农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049；2.山东玉兔食品股份有限公司，山东 淄博 255300)

丁酸(butyric acid)又名酪酸，是一种挥发性短链脂肪酸，天然丁酸主要由丁酸梭菌属(Clostridium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、酪酸杆菌属(Butyribacterium)、八联球菌属(Sarcina)和梭杆菌属(Fusobacterium)等合成[1-2]。丁酸是人体大肠中产丁酸细菌的主要代谢产物，同时也是人肠道上皮细胞的主要营养物质[3]。据报道，丁酸及其盐类具有预防和治疗结肠癌、肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、溃疡性结肠炎以及血红蛋白病等功能[3-5]，并可以间接辅助治疗肝损伤[6]。近年来，丁酸及其衍生物在食品、药品、饲料等方面的应用逐渐被重视，具有良好的应用前景[7-8]。

建立精确度高、重复性好的丁酸定量分析方法是富丁酸功能性食品研发的前提条件。食醋是人们生活中必不可少的调味品，食醋发酵过程中各种微生物的代谢活动会产生种类丰富的有机酸，所以对人体有抗菌、抗癌、减肥、降压、控制血糖等作用[9]，作为功能性食品已经开发出苹果醋、葡萄醋、苦荞醋、柿子醋、红枣醋、玫瑰醋等[10-17]多种产品。然而，由于普通食醋中丁酸含量极低，常常不被作为有机酸主要成分来测定，因此鲜有报道。目前高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)是食醋中有机酸检测最常用的方法[18-24]。丁酸作为小分子有机酸，只有4个碳原子，极性较大，利用高效液相分析时，在常用的C18反相柱上保留效果较差，样品中杂峰较多时，需要提高相对保留值才能获得较好分离度，然而这往往对色谱柱和泵的使用寿命有影响。此外，液相具有维护费用高、流动相配制复杂、有机试剂消耗量大的特点，分析成本较高。本研究利用气相色谱对食醋中的丁酸含量进行定量分析，对比3种不同预处理方法对食醋中丁酸提取效率的影响，旨在寻找一种最佳的预处理方法，为富丁酸食醋或其他功能性食品中丁酸的提取、分析及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米醋、陈醋、香醋、小米醋和白醋从淄博当地超市购买；富丁酸醋由本实验室制备。丁酸标准品(纯度≥99.5%)， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙醚均为色谱纯，德国Meker公司；乙酸锌、氯化钠、高氯酸、氢氧化钠、磷酸、硫酸、无水硫酸钠、亚铁氰化钾等均为分析纯，国药集团试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 6890N气相色谱仪(配有FID检测器) ，美国安捷伦科技公司；DM-FFAP色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)， 迪马科技；5810R型离心机，Eppendorf(艾本德)公司；LE3002E/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司；QL-861型漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；实验室通风橱，淄博豪迈实验室装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 气相色谱条件

色谱柱：DM-FFAP色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升温程序：初始温度100 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min的速度升至240 ℃保持5 min。进样口温度250 ℃，检测器温度260 ℃；载气为氮气，氮气流速为40 mL/min，氢气流速为60 mL/min，空气流速为400 mL/min；进样量为1 μL。

1.3.2 乙醚萃取法

丁酸属于挥发性小分子有机酸，极易溶于水，但在水中的绝对浓度相对较低，不易被检测，因此本实验选用极性较强的乙醚作为提取溶剂。准确量取5 mL醋样于50 mL离心管中，加入5 mL纯水、1 mL 10.6%亚铁氰化钾溶液和1 mL 30%乙酸锌溶液，充分涡旋振荡后静置5 min，4 000 r/min离心5 min；然后将上清液转移至100 mL分液漏斗，加入20 mL乙醚，充分振荡后静置，收集乙醚层，剩余水层用20 mL乙醚分别提取两次，合并乙醚相于200 mL旋蒸瓶中，30 ℃减压旋蒸至剩余1 mL左右，转移浓缩液，加少量纯乙醚清洗旋蒸瓶壁，将清洗液与浓缩液合并，用乙醚定容至2 mL。待测液用0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。

1.3.3 甲酯化-正己烷法

甲酯化是广泛应用于有机酸的衍生化方法，因为有机酸的极性很强且热稳定性又较低，所以通常要将这些酸转化为弱极性的酯类衍生物，以增大挥发性及热稳定性，便于进行气相色谱分析。本方法在林杨[25]方法的基础上有所改进，分别取2 mL醋样于10 mL的离心管中，再加入1 mL 10.6%亚铁氰化钾溶液和1 mL 30%乙酸锌溶液，摇匀后静置5 min，4 000 r/min离心5 min。收集上清液并定容至5 mL，取1 mL于具塞试管中，加入250 μL 5 mol/L的磷酸溶液，混匀2 min，加入1.5 mL 1%的硫酸-甲醇溶液，充分混匀后70 ℃水浴6 h，取出冷却至室温，加1 mL正己烷混匀后静置分层，取0.6 mL正己烷层过0.22 μm微孔滤膜后进样。

1.3.4 甲酯化-二氯甲烷法

本方法在谢文明等[26]方法的基础上有所改进，分别取2 mL醋样于10 mL的离心管中，再加入1 mL 10.6%亚铁氰化钾溶液和1 mL 30%乙酸锌溶液，摇匀后静置5 min，4 000 r/min离心5 min。将上清液全部转移至离心管中，加1 mL 12.5%硫酸-甲醇溶液，充分混匀后60 ℃水浴4 h，取出冷却至室温，加入2 mL二氯甲烷，涡旋混匀3 min，4 000 r/min离心5 min；收集二氯甲烷层，重复萃取2次，合并二氯甲烷提取液并定容至6 mL，加入1.5 mL饱和NaCl，充分混匀后静置分层，取1 mL二氯甲烷层，用0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。

1.3.5 富丁酸醋的制备

将加入了500 g大米和2 000 mL蒸馏水的发酵罐置于72 ℃恒温水浴中，加入7 g α-淀粉酶，水解2 h，自然冷却至室温。将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的种子培养液按3%的接种量转接到大米水解液中，在37 ℃恒温培养箱内发酵24 h；丁酸发酵结束后，将浸泡好的乌衣红曲加入到发酵罐内，置于28 ℃恒温培养箱发酵15 d后，将酒醅离心，取每100 mL上清液分装在三角瓶成为醋酸发酵液。将醋酸菌种(沪酿 1.01)按照 3%的接种量接入三角瓶，进行摇床培养(28 ℃，180 r/min)。发酵6 d后取出，将富丁酸醋置于高温灭菌锅进行121 ℃、30 min灭菌，得到富丁酸醋。

1.4 数据处理

本研究利用外标法定量，利用 Microsoft Excel 2017软件对数据进行处理，利用 SPSS 21.0统计软件对数据进行差异显著性分析，利用Origin 8.5软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 保留时间和峰形的测定结果

将丁酸标准品按照3种预处理方法进行提取，经过气相色谱测定，得到标准品的色谱图如图1所示。3种预处理方法处理后的目标物保留时间分别为9.20、9.25、9.50 min，保留时间附近均没有其他杂峰干扰。图1(a)为用乙醚萃取处理后得到的丁酸峰，其响应值较高，峰型也较好；图1(b)为利用1%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用正己烷萃取得到的色谱图，其丁酸的响应值明显低于其他两种方法；图1(c)为12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用二氯甲烷萃取得到的色谱图，其丁酸的响应值最高，保留时间最长。甲酯化后的丁酸保留时间与乙醚萃取的丁酸保留时间有所不同，比较两种甲酯化方法发现，利用12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用二氯甲烷萃取得到的丁酸甲酯保留效果较好，可能因为丁酸作为低碳链有机酸极性相对较大、二氯甲烷较之正己烷极性也较大，因此甲酯化后利用二氯甲烷萃取在FFAP色谱柱上也有较好的峰形和保留。

(a)经乙醚萃取法处理

2.2 标准曲线、线性范围、检出限和检测限的测定结果

将丁酸标准品按照不同浓度梯度稀释后，分别按照3种不同方法进行预处理，经气相色谱分析，根据结果绘制得到3条标准曲线，根据信噪比(S/N)确定检测限(RSN = 10)和检出限(RSN = 3)。如表1所示，不同方法处理后的标准品均呈现良好的线性关系，其相关系数范围为0.999 2～0.999 8，检测限范围为0.016～0.177 mg/mL，检出限为0.005～0.072 mg/mL。其中，乙醚萃取法的检出限和检测限最低，而甲酯化-正己烷法的最高。这是由于乙醚萃取法是直接用乙醚进行提取，步骤简单，过程中损失较少；而甲酯化的方法都相对复杂，过程中转移步骤较多，会造成一定的损失。但是，乙醚挥发性强，在提取过程中不易控制，结果稳定性较差。

表1 不同方法处理后丁酸的标准曲线、相关系数、线性范围、检测限和检出限

2.3 回收率和精确度的测定结果

向已知丁酸浓度的食醋样品中分别加入质量浓度为0.46、0.87、2.25 mg/mL的丁酸标准品，将加标后的样品分别按照3 种不同提取方法进行预处理。每个加标平行6次，回收率和相对标准偏差结果见表2。由表2可知，乙醚萃取法的回收率范围为58.69%～112.45%，平均回收率为85.57%，其中白醋回收率最高，可能是由于白醋的成分与其他醋相比较简单，提取时干扰物相对较少。甲酯化-正己烷法和甲酯化-二氯甲烷法的回收率范围分别为71.26%～111.49%和87.36%～106.52%，平均回收率分别为91.38%和96.94%。乙醚萃取法的回收率不稳定，这与不同样品属性有关；同时，因为乙醚容易挥发，重复性难以控制，所以相对标准偏差在0.54%～4.87%之间。两种甲酯化方法与乙醚萃取法相比回收率高且相对稳定，标准偏差范围分别为0.23%～3.49%和0.24%～4.31%。而且，食醋的发酵过程复杂，产生的丁酸可能与其他代谢产物反应，而不是以游离的丁酸存在；因此，即使乙醚萃取法的检测限最低，但在实际测定中，可能还会遗漏部分丁酸含量，使准确度相对较低。从两种甲酯化方法得到的结果来看，甲酯化-二氯甲烷法的回收率范围更接近100%，平均回收率也更高，这可能与硫酸-甲醇溶液中硫酸的含量有关。王韦岗等[27]利用硫酸-甲醇溶液对食品中常见的12种有机酸进行衍生，并通过气相色谱法对衍生物进行测定，考察了不同体积分数的硫酸-甲醇溶液对衍生效果的影响，结果发现包括丁酸在内的12种有机酸衍生物的峰面积与硫酸-甲醇溶液的体积分数成正比，此结果与本实验的结论一致。

表2 不同方法处理后5种食醋样品中的丁酸回收率和精确度 (n=6)

2.4 样品分析

食醋发酵分为多个阶段，其中丁酸发酵阶段是本实验室酿制富丁酸醋的特殊环节，因此考察此过程中丁酸含量的变化对发酵工艺的控制和优化有着至关重要的作用。本研究采用甲酯化-二氯甲烷法对发酵醪中的丁酸进行萃取，利用气相色谱仪进行测定，结果如图2所示。由图2可知，在10 d的发酵期间，富丁酸醋中丁酸含量整体呈上升趋势，在第8 d后趋于平缓。丁酸含量变化范围为1.31～2.36 mg/mL，对照组(并未接种丁酸菌)为0.051～0.109 mg/mL。王贵双等[28]通过对酿造、配制食醋和固态、液态发酵食醋各有机酸的百分含量进行分析得出：酿造食醋中有机酸含量从高到低分别为乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、甲酸、丙酮酸、草酸和丙酸；配制食醋中有机酸含量从高到低分别为乙酸、乳酸、柠檬酸、甲酸、丙酸、琥珀酸、丙酮酸和草酸；固、液态发酵食醋中有机酸含量从高到低的顺序与酿造食醋的顺序相同。可见在大多数食醋中自然产生的丁酸含量极其少，因此富丁酸食醋的开发对于丰富功能性保健食醋的种类具有重要意义。

图2 富丁酸醋发酵醪中丁酸的含量变化

3 结束语

本实验采用3种不同的方法处理5种食醋，利用气相色谱法检测食醋中的丁酸，通过对实验数据及实验现象的分析发现，不同的预处理方法对检测食醋中丁酸的含量会产生不同的影响，12.5%硫酸甲醇溶液甲酯化与二氯甲烷萃取结合的方法是最适合检测丁酸的预处理方法。

乙醚萃取法操作简单，气相色谱图中有机酸的分离度高、峰型较好且响应度较高，但由于乙醚的挥发性，导致气相分析的结果不稳定，加标回收率在58.69%～112.45%之间，相对标准偏差的范围为0.54%～4.87%，准确度较低；1%硫酸-甲醇甲酯化与正己烷萃取结合法，结果比较稳定，加标回收率在71.26%～111.49%之间，相对标准偏差较小，在0.23%～ 3.49%之间，但色谱图的峰型差、有拖尾现象且响应值很低，对色谱柱会造成损害，其操作繁琐、耗时长；12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化与二氯甲烷萃取结合法，操作虽然稍微复杂且耗时较长，但气相分析的结果最理想，有机酸的分离度较高，丁酸峰型最好，无拖尾现象，响应值也最高，而且回收率最稳定，在87.36%～106.52%之间，相对标准偏差在0.24%～4.31%之间。综合以上分析，用12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后再用二氯甲烷萃取的方法是最适合气相检测食醋中丁酸含量的方法。