耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌头孢他啶/阿维巴坦的敏感性分析及疗效评价

陆燕飞，郑秀华，张晓慧，金菲，倪芳，梅亚宁，许雨乔(. 南京医科大学第一附属医院检验学部，南京009；. 临沂市妇幼保健院检验科，山东临沂76000)

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)的检出率逐年增高[1]，给临床抗感染治疗带来新的难题与挑战。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药主要机制[2]。碳青霉烯酶包括A、B、D类酶，其中A类和D类为丝氨酸碳青霉烯酶，B类为金属碳青霉烯酶[3]。CRE碳青霉烯酶分型检测对选择恰当的治疗方案至关重要[4]。头孢他啶/阿维巴坦(ceftazidime-avibatan，CAZ/AVI)由头孢他啶和新型β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦组合而成，2019年被国家药品监督管理局推荐用于治疗CRE引起的复杂性腹腔感染和医院获得性肺炎等[5]，但其临床疗效研究尚不完善。本研究分析南京医科大学第一附属医院临床分离170株CRE菌株碳青霉烯酶酶型以及对CAZ/AVI的敏感性，并回顾性分析CAZ/AVI的临床疗效，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2019年9月—2020年5月南京医科大学第一附属医院临床连续分离非重复CRE菌株170株。菌株鉴定采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪并用Vitek MS复核，药敏试验采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪，亚胺培南或美罗培南最低抑菌浓度(MIC)≥4 μg/mL判为CRE菌株。回顾性分析170例CRE感染患者临床资料，37例使用CAZ/AVI治疗的患者作为试验组，患者均联合其他抗菌药物(合并碳青霉烯类抗菌药物15例，头孢哌酮/舒巴坦10例，替加环素6例，阿米卡星3例，多黏菌素2例和左氧氟沙星1例)；18例为下呼吸道感染，12例血流感染，6例腹腔感染和1例颅内感染；病原菌分别为肺炎克雷伯菌(36株)和大肠埃希菌(1株)；均为产丝氨酸碳青霉烯酶CRE，对CAZ/AVI均敏感。以性别、年龄、基础疾病(恶性肿瘤、严重外伤、近期手术、严重感染性疾病、心功能不全)、入住ICU、侵袭性操作、气管切开、感染部位和CRE酶型评估患者的倾向性评分值，通过邻近匹配法从未使用CAZ/AVI治疗患者中成功匹配到37例患者作为对照组，两组在基础疾病、临床特征等方面差异均无统计学意义。对照组中34例单药治疗(碳青霉烯类抗菌药物15例，替加环素6例，头孢哌酮/舒巴坦13例)，3例联合治疗(替加环素联合比阿培南1例，替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦1例，比阿培南联合头孢哌酮/舒巴坦1例)，病原菌分别为肺炎克雷伯菌(36株)和大肠埃希菌(1株)，且均为产丝氨酸碳青霉烯酶CRE，对CAZ/AVI敏感。呼吸道感染、血流感染、腹腔感染和颅内感染均以我国卫生部制定的《医院感染诊断标准》[6]为诊断标准。

1.2主要仪器、试剂及菌株来源 Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)；亚胺培南、美罗培南、CAZ/AVI药敏纸片、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(美国Thermo Fisher公司)；头孢他啶和阿维巴坦粉剂(美国辉瑞公司)；哥伦比亚血平板、巧克力平板、麦康凯平板和 M-H 琼脂平板(郑州安图生物公司)；EDTA(中国碧云天公司)；H-1微型混合器(中国康禾公司)。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706和肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146，购自上海汉尼生物细胞技术公司。

1.3药物敏感性试验 用K-B纸片扩散法复核药敏结果，重复试验3次。K-B纸片扩散法结果判读根据CLSI M100-S30[7]，CAZ/AVI抑菌圈直径≥21 mm为敏感，抑菌圈直径≤20 mm为耐药。抑菌圈直径为20～22 mm的菌株再用肉汤稀释法复核。CAZ/AVI肉汤稀释法：将头孢他啶药物浓度倍比稀释(0.5～512 μg/mL)，以每孔50 μL加入96孔板中，使其终浓度为0.125～128 μg/mL；将阿维巴坦药物浓度稀释至16 μg/mL，以每孔50 μL加入96孔板中，使其终浓度为4 μg/mL。制备菌株为0.5麦氏浊度单位的菌悬液，1∶100稀释后按每孔100 μL加入至96孔板，35 ℃温育18～24 h，读取结果。CAZ/AVI MIC≤8/4 μg/mL为敏感，≥16/4 μg/mL为耐药。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.4碳青霉烯酶酶型检测 根据CLSI M100-S30，采用mCIM联合eCIM试验检测碳青霉烯酶。mCIM试验：取1 μL满环菌落接种至2 mL胰蛋白胨大豆肉汤中，震荡混匀后放入1张10 μg美罗培南纸片并浸没于菌悬液中，35 ℃温育4 h。制备0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC 25922悬液涂布M-H平板；将美罗培南纸片从肉汤中取出并贴于M-H平板上，35 ℃温育18～24 h后量取抑菌圈直径。eCIM试验：mCIM试验同时取第2支含2 mL胰蛋白胨大豆肉汤的试管，加入20 μL 0.5 μmol/L乙二胺四乙酸溶液，剩余步骤同mCIM试验。mCIM和eCIM试验同步进行。结果解释：mCIM阳性，细菌产碳青霉烯酶；mCIM阴性，细菌不产碳青霉烯酶。mCIM阳性且eCIM阳性，细菌产金属碳青霉烯酶；mCIM阳性且eCIM阴性，细菌产丝氨酸碳青霉烯酶[8]。肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706分别作为mCIM试验的阳性和阴性对照，肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-2146作为eCIM试验的阳性对照。

1.5疗效评价试验 疗效判断标准：(1)治愈：感染症状、病原学检查和实验室检查均恢复正常；(2)有效：治疗后患者感染症状基本消失或明显减轻；(3)无效：治疗后患者感染症状无改善、病情恶化或死亡[9]。比较两组临床有效(包括治愈、有效)和无效的病例数。

1.6统计学分析 用GraphPad软件进行。计数资料用例数(百分比)表示，采用Pearsonχ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1mCIM联合eCIM试验结果 170株CRE菌株中，mCIM阳性165株，eCIM阳性35株；产丝氨酸碳青霉烯酶130株，产金属碳青霉烯酶35株，不产碳青霉烯酶菌株5株。146株肺炎克雷伯菌中mCIM阳性143株，eCIM阳性18株。12株大肠埃希菌中mCIM阳性10株，eCIM阳性2株。见表1。

表1 CRE菌株mCIM联合eCIM结果(株)

2.2CAZ/AVI药敏结果 K-B法实验结果显示，CRE对CAZ/AVI的敏感率为78.8%(134/170)，产丝氨酸酶CRE菌株对CAZ/AVI的敏感率为99.2%(129/130)，产金属酶CRE敏感率为0(0/35)，两组差异有统计学意义(χ2=158.218，P<0.001)。52株CAZ/AVI抑菌圈直径在20～22 mm范围内的CRE用肉汤稀释法复核的MIC分布：CAZ/AVI=22 mm组MIC范围为1/4～8/4 μg/mL，CAZ/AVI=21 mm组MIC范围为1/4～16/4 μg/mL。获得1株假性敏感CRE，产丝氨酸碳青霉烯酶，CAZ/AVI抑菌圈直径为21 mm，MIC为16/4 μg/mL(耐药)。

2.3CAZ/AVI疗效评价 试验组、对照组患者治疗有效率分别为70.3%和45.9%，差异有统计学意义(χ2=4.497，P<0.05)，但两组治疗30 d患者病死率分别为32.4%和27.0%，差异无统计学意义。试验组中下呼吸道感染患者和血流感染患者CAZ/AVI治疗有效例数高于对照组(P均<0.05)，见表2。6例腹腔感染和1例颅内感染使用CAZ/AVI治疗后，4例腹腔感染和1例颅内感染患者临床症状得到有效缓解。

表2 下呼吸道感染患者和血流感染患者的CAZ/AVI临床疗效比较

3 讨论

本研究结果显示，产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制，86.21%肺炎克雷伯菌通过产丝氨酸碳青霉烯酶对碳青霉烯类抗菌药物耐药。大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和产气克雷伯菌等主要产金属碳青霉烯酶，弗氏柠檬酸杆菌和斯氏普罗威登菌各分离1株，均为产金属碳青霉烯酶CRE，结果与Zhang等[10]对全国CRE耐药基因分析数据一致。目前临床使用的新型抗菌药物CAZ/AVI对大多数丝氨酸碳青霉烯酶CRE有活性，但对金属碳青霉烯酶CRE没有活性[11]，因此CRE的碳青霉烯酶分型对于临床精准诊疗至关重要。本研究结果显示，CRE对CAZ/AVI的敏感率为78.8%，对产丝氨酸碳青霉烯酶CRE敏感率为99.2%(129/130)。复核52株抑菌圈直径在20～22 mm的CRE，获得1株产丝氨酸碳青霉烯酶CRE、CAZ/AVI抑菌圈直径为21 mm(敏感)而MIC耐药的假性敏感菌株，假敏感率为1.90%。目前国内尚未有相关数据报道。K-B法方法学的局限性以及CAZ/AVI纸片中头孢他啶和阿维巴坦的含量与临床使用剂量不同，可能使抑菌圈直径在20～22 mm内的菌株存在一定的假性敏感或耐药。

试验组经CAZ/AVI治疗后总有效例数高于对照组，但两组30 d死亡率无差异，CAZ/AVI能够有效治疗CRE引起的感染，但因两组患者病情严重，且多存在侵袭性操作，控制感染并不能显著降低患者死亡率。下呼吸道感染患者治疗有效例数高于对照组(P<0.005)，6例腹腔感染患者使用CAZ/AVI治疗后有4例患者感染症状缓解，证实CAZ/AVI用于治疗腹腔感染和肺炎效果较好。对于CRE引起的血流感染，试验组有效例数高于对照组，差异有统计学意义，尚需更大样本、高质量的临床研究来验证此结果。对于产金属碳青霉烯酶CRE引起的感染，阿维巴坦联合氨曲南具有良好的抗菌作用[12]。综上所述，产丝氨酸碳青霉烯酶的CRE对CAZ/AVI有很高的敏感性，CAZ/AVI可显著提高治疗上述CRE感染的有效率。