有棱丝瓜耐热性种质资源筛选与耐热生理响应

朱德宁 刘素娜 赵绮薇 曹翠文 李莲芳

摘要：开展有棱丝瓜耐热性材料筛选与鉴定试验，通过对30个品种高温处理并进行耐热性资源评价与耐热性品种筛选，再从中选出3个不同耐热性材料研究有棱丝瓜在高温胁迫下的生理响应机制。30个有梭丝瓜品种中，泰国丝瓜2等4个品种是耐热品种;2017肉资-13等9个品种为较耐热品种;泰国丝瓜1等6个品种是不耐热品种;2018RZ-20等11个品种为热敏品种。通过对耐热品种2018RZ-19、较耐热品种2017肉资-13和热敏品种 2018CL-8 进行高温胁迫，分别测定叶片细胞中相对电导率等生理指标。测定结果显示，叶片的细胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量均随着高温胁迫时间的延长而有不同程度增加。保护酶活性对植物高温胁迫有一定影响，叶绿体色素含量随着高温胁迫时间的延长有所下降。对丝瓜耐热性品种进行筛选及综合评价分析，对有棱丝瓜种质资源的收集与遗传育种具有指导性意义。

关键词：有棱丝瓜;耐热性;生理响应;高温胁迫;种质资源;综合评价

中图分类号： S642.401  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）09-0132-06

丝瓜分为普通丝瓜[Luffa cylindrical （L） Roem.Violales]和有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]2个栽培种，主要分布于热带、亚热带的亚洲各地，在我国南北均有栽培，是我国主要的瓜类蔬菜，广东省等南方地区以栽培有棱丝瓜为主。有棱丝瓜别称广东丝瓜，在华南简称为丝瓜，是葫芦科丝瓜属一年生攀缘草本植物，也是华南地区特产蔬菜之一[1-2]。有棱丝瓜为短日照植物，生物学特性喜温耐湿，适宜其生长的环境温度为20～30 ℃[3]。植物在长时间高温条件下会破坏细胞膜结构，致使细胞内溶物外渗，细胞膜内外渗透平衡将受到影响，甚至导致细胞膜结构破坏，从而引起植株损伤甚至死亡[4-5]。在生产上温度过高会导致丝瓜生长缓慢、产量下降、畸形瓜增多、品种下降等问题。

在我国南方地区，夏季炎热，高温高湿，大棚内温度更是高达42 ℃以上，对植物的生长发育甚至夏季蔬菜的市场供应影响极大[6]。植物高温胁迫反应往往与植物种类、植物生长发育阶段、植物器官部位与发育阶段等有关[7]。丝瓜作为华南地区特色蔬菜之一，夏秋2季温度偏高，田间温度甚至高至40 ℃左右，对丝瓜的生长发育及品种选育产生较大的影响。因此，开展丝瓜耐热性种质资源综合评价及高温胁迫的生理响应，对提高丝瓜品质质量与遗传育种有重大意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验材料为30份有棱丝瓜核心种质资源，由广州市农业科学研究院及国内外引进的有棱丝瓜品种（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 有棱丝瓜苗期耐热性筛选与鉴定 试验于2019年7—11月在广州市农业科学研究院南沙试验基地进行。每个品种取种子20 g，温汤浸种后，用纱布或棉布吸干水分，然后放置恒温箱32 ℃左右下催芽，露白后即可播种[8]。采取穴盘育苗，将种子播于装有基质（草炭 ∶ 蛭石=3 ∶ 1）的32孔穴盘中，于光/暗周期14 h/10 h、温度25 ℃条件下育苗。当出苗率达到50%～60%后，揭去黑纱。1～2 d之后，移至田间，便于通风补光以促使幼苗健壮生长。15 d左右，当植株幼苗生长至1～2张真叶时，选取健壮幼苗20株，移至光照培养箱（宁波江南仪器厂生产）中培养。开始先在光照培养箱中适应1 d， 然后将光培箱温度设置为白天45 ℃、夜间30 ℃，相对湿度设置为75%光照度设置为全光照 171.4 μmol/（m2·s），光—暗周期12 h—12 h，高温处理 5 d。

1.2.2 热害指数与热害等级分级 将上述30个核心种质苗期移至光培箱进行高温处理，每天記录并统计幼苗的热害情况，热害程度包括子叶、真叶、心叶以及下胚轴及整株生长状况，并进行拍照记录。通过隶属函数法与聚类分析法对30个品种的耐热性进行综合评价分析，初步筛选出有棱丝瓜耐热性品种。根据不同品种在高温胁迫下产生不同的热害症状，将热害症状进行分级处理。结合前人的研究经验，将热害根据症状的轻重程度划为0级、1级、2级、3级和4级。0级，即植株幼苗生长正常，无热害;1级，植株幼苗1～2张叶稍微黄化，症状轻微;2级，植株幼苗1～2张叶片或真叶开始发黄，生长缓慢;3级，植株幼苗失水较多，2～3张叶或真叶萎蔫，心叶不正常;4级，整株叶片萎蔫或者枯死，下胚轴失水严重，心叶萎缩，植株倒伏严重（图1）。

1.3 高温胁迫下有棱丝瓜生理指标测定

根据丝瓜苗期耐热性品种的筛选，开展丝瓜对高温胁迫的生理响应，选取3个品种，分别为耐热品种2018RZ-19、较耐热品种2017肉资-13、热敏品种2018CL-8。将以上3个品种苗期移至光培箱，并进行高温胁迫处理，条件设置为45 ℃（白天），30 ℃ （夜间），相对湿度为75%，全光照 171.4 μmol/（m2·s），光暗周期设置为12 h/12 h。在高温处理0、1、2、3 d条件下通过测定其相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量、保护酶活性及叶绿素含量等生理指标，探索不同耐热性丝瓜对高温胁迫的生理响应。

1.3.1 相对电导率测定 在丝瓜幼苗经高温处理后的0、1、2、3 d分别采集叶片，每个品种的同一叶位各取1张完全展开叶，1个品种采3株，共3个重复。将叶片在超纯水中洗净并擦干。采用 1.0 cm 的打孔器提取植株小叶片10张，放进试管中，加入15 mL蒸馏水。设置3个不同温度条件，分别为室温、50、100 ℃。首先，室温下把小叶片和蒸馏水一起大力摇晃30 min后测量水溶液传导电流的能力（EC0）;再放进50 ℃水浴中加热30 min后，拿出来待温度降至室温后测量水溶液传导电流的能力（EC1）;之后置于100 ℃水浴煮沸5 min后，拿出来待温度降至室温后测量水溶液传导电流的能力（EC2），重复3次，取平均值。相对电导率的计算公式：RC=（EC1-EC0）/（EC2-EC0）×100%[9-10]。

1.3.2 丙二醛含量与可溶性糖含量测定 采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定丙二醛含量和可溶性糖含量[11-12]。在丝瓜幼苗经高温处理后0、1、2、3 d条件下分别采集叶片，在同一叶位各取1张完全展开叶，重复3次。将叶片清洗干净并擦干。用电子天平称取0.1 g叶片，放入研钵中，加入1.8 mL 10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂研磨至匀浆，然后再加入4 mL 10%三氯乙酸（TCA）进一步充分研磨，将匀浆转移到离心管中，4 000 r/min离心 10 min; 取上清液1 mL， 加入1 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混匀后在沸水浴上煮15 min，待冷却再离心1次，取上清液在波长450、532、600 nm下的分别测定上清液吸光度，之后根据丙二醛（MDA）与可溶性糖含量显色反应测定叶片中MDA含量与可溶性糖含量。

1.3.3 叶绿素含量测定 叶绿素含量采用李合生的方法[13]测定。在丝瓜幼苗经高温处理后0、1、2、3 d条件下分别采集叶片，用清水清洗干净并擦干，然后将叶片剪碎;称取叶片0.2 g，转至研钵中，加入适量乙醇，少量碳酸钙粉和石英砂，研磨成匀浆，再加入乙醇10 mL，继续充分研磨至组织转白色，净置。待静置完之后，将其倒入25 mL棕色容量瓶中，用乙醇清洗干净研钵表面，最后定容至 25 mL，上下摇匀充分;用1 cm比色皿测量其在665、649、470 nm的吸光度，数据处理与统计。

1.3.4 保护酶活性的测定 在丝瓜幼苗经高温处理后的0、1、2、3 d采集叶片，在同一叶位各取1张完全展开叶，在超纯水中洗净并擦干。采用愈创木酚法测定POD活性，氮基四唑（NBT）法测定SOD活性[2]，南京建成生物工程研究所试剂盒测CAT活性。

2 结果与分析

2.1 有棱丝瓜耐热性品种筛选与热害分级

通过对30个有棱丝瓜试验品种进行高温处理，结合耐热指数统计分析，对有棱丝瓜耐热性进行综合评价分析，确定耐热症状分级。然后利用聚类分析法对30个丝瓜品种进行聚类分析，将30个有棱丝瓜品种划分成耐热品种、较耐热品种、不耐热品种和热敏品种4个类型。其中，耐热品种包括泰国丝瓜2、2018RZ-19、绿胜3号、2018RZ-7 4个品种;较耐热品种包括2017肉资-13、2019DS-11、夏胜4号等9个品种，不耐热品种包括泰国丝瓜1、2013示范-长资-6-2、2014NSCT-32等6个品种;热敏品种有2018RZ-20、2012-分离-长-32-2、2018RZ-37等11个品种（表2）。

2.2 细胞膜透性的变化

高温胁迫后，有棱丝瓜的细胞膜相对电导率呈增加趋势。高温胁迫之前，不同耐热性有棱丝瓜品种的细胞膜透性差异不明显（图2）。高温处理1 d后，不同耐热性品种的细胞膜透性差异变化也不大。而在高温胁迫处理3 d后，3个品种的相对电导率明显增大，热敏品种2018CL-8和较耐热品种2017肉资-13的相对电导率明显高于耐热品种2018RZ-19，其中热敏品种2018CL-8的相对电导率变化最大，增加了126.08%，较耐热品种2017肉资-13的相对电导率上升了58.91%，而耐热品种2018RZ-19的相对电导率仅上升了6.14%。由此可见，受到高温胁迫之后，耐热性品种细胞膜可能会保持比较稳定，透性变化不大;而热敏品种在高温胁迫下，细胞膜受损比较严重，通透性加大，从而导致电导率快速上升。

2.3 丙二醛含量的变化

不同高温处理时间对有棱丝瓜丙二醛含量有比较大的影响。正常情况下，3个品种丙二醛的含量差异不明显，基本在0.01 μmol/g。经过高温处理2 d后，3个品种的丙二醛含量明显上升，其中热敏品种2018CL-8的丙二醛含量变化最大。而在持续高温胁迫处理3 d后，不同耐热性品种的丙二醛含量均增加至最大值（图3），其中热敏品2018CL-8的丙二醛含量增大了179.67%，较耐热品种2017肉资-13的丙二醛含量增大至135.58%，耐热品种2018RZ-19变化最小，为51.02%。结果表明，高温胁迫对有棱丝瓜丙二醛含量有影响，在一定程度上，随着高温处理时间延长会导致丙二醛含量增大，说明丙二醛含量与耐热性有一定关系。因此，高温处理下耐热品种的丙二醛变化比热敏品种小。

2.4 可溶性糖含量的变化

可溶性糖含量的变化与丙二醛含量有点类似。在高温处理0、1 d，不同耐热性品种的可溶性糖含量的变化差异不明显（图4）。但3个品种可溶性糖含量随着高温胁迫时间的延长都有一定的上升，在高温处理2 d后，可溶性糖含量变化明显，其中，热敏品种2018CL-8的可溶性糖含量变化最大，耐热品种2018RZ-19的可溶性糖含量影响比较小。高温胁迫3 d后，热敏品种2018CL-8的可溶性糖含量是高温处理之前的4.57倍，较耐热品种2017肉资-13、耐热品种2018RZ-19分别是高温处理之前的2.56倍、2.03倍。表明高温胁迫下耐热性强的品种新陈代谢运动可能比耐热性弱的品种小，植物在高温胁迫下通过增加可溶性糖含量来提高细胞的渗透浓度，保持细胞内外渗透的平衡，从而提高自身的抗逆性。

2.5 叶绿素含量的变化

叶绿素含量随着高温胁迫处理时间的延长有所下降（图5）。在高温胁迫处理0、1 d时，高温胁迫对不同耐热性品种叶绿素含量基本无影响，保持比较稳定。随着高温处理2 d之后，叶绿素含量开始下降，而且下降幅度明显加快，处理3 d后下降至最低。其中，热敏品种2018CL-8的叶绿素含量下降最大，比高温处理之前下降67.3%，较耐热品种2017肉资-13、耐热品种2018RZ-19的叶绿素含量分别下降39.7%、26.9%。由此可以看出，高温胁迫下叶绿素含量会有所下降，并且高温处理时间越长，叶绿素含量下降越明显。表明叶绿素含量的变化与植物耐热性或许有关系。高温胁迫会使植物的葉绿素合成减少，叶片稍微发黄，叶绿素含量下降。

2.6 高温胁迫下SOD活性变化

从图6可以看出，高温处理后，SOD活性呈现上升趋势或先上升、后下降趋势。在高温处理前，不同耐热性品种的SOD活性差异并不明显。高温处理 1 d 后，3个品种的SOD活性出现了微小差异，而且不同耐热性品种的SOD活性均呈小幅度上升趋势。其中，耐热品种2018RZ-8的上升幅度比热敏品种2018CL-8和较耐热品种2017肉资-13大。在高温处理2 d，热敏品种2018CL-8上升幅度最大，SOD活性上升了478%，耐热品种2018RZ-19和较耐热品种2017肉资-13分别上升了154%、318%。高温处理3 d后，热敏品种2018CL-8与耐热品种2018RZ-19 SOD活性开始呈下降趋势。

2.7 高温胁迫下POD活性变化

高温处理后，有棱丝瓜细胞中POD活性呈现先上升、后下降、再上升的趋势（图7）。高温处理 0 d，3个品种有棱丝瓜细胞中的POD活性无明显差异。高温处理1 d，3个品种的POD活性均上升明显，其中，热敏品种2018CL-8上升最快，达原含量的2173%;较耐热品种2017肉资-13、耐热品种2018RZ-19分别增加了947%、511%。高温处理 2 d 后，POD活性减小，其中，热敏品种2018CL-8下降最明显。高温处理3 d，3个品种的POD活性开始上升。表明植物细胞通过调节POD酶的活性来抵御高温胁迫导致的机体产生的过量的H2O2，POD活性升高，对H2O2的清除能力增强。

2.8 高温胁迫下CAT活性变化

高温处理后，有棱丝瓜细胞中，CAT活性呈下降趋势（图8）。高温处理0 d，3个品种有棱丝瓜细胞中的CAT活性无明显差异。高温处理1 d，热敏品种2018CL-8、较耐热品种2017肉资-13和耐热品种2018RZ-19的CAT活性均急速下降，基本下降了200%左右，其中，热敏品种2018CL-8下降最多，下降了218%。高温处理2 d，3个品种的CAT活性均下降，但下降不明显。高温处理 3 d，3个品种的CAT活性差异不明显。

3 讨论

植物在生长过程中，因外界环境因素往往会受到各种非生物胁迫的影响，高温是影响植物生长因素之一。因此，有棱丝瓜的热害指数、耐热机制的生理调控及耐热材料的筛选对其耐热性鉴定和耐热资源的综合性评价有重要作用。耐热性综合评价涉及植物形态、光合作用、渗透调节、保护酶活性等生理特性及基因表达方面[14]。本试验通过有棱丝瓜苗期高温胁迫处理，建立有棱丝瓜苗期热害胁迫评价体系，将其进行热害症状分级，统计热害指数，采用隶属函数法和聚类分析法对30个有棱丝瓜品种进行了耐热性鉴定，初步筛选出耐热性品种4个，热敏品种11个。通过试验表明，耐热性强的品种与不耐热品种在高温胁迫下生理反应存在明显差异。高温胁迫会导致植物细胞膜完整性丢失，进而导致细胞膜渗透性增加和电解质分解增大。丙二醛是细胞膜过氧化产物，也是细胞膜被破坏的标志物质。可溶性糖是植物细胞渗透调节物质。叶绿素是植物体内的主要光合色素，受温度影响比较大，其含量变化与植物的生长发育密切相关，又是植物光合作用不可缺少的物质[15]。在高温胁迫前期，植物体内催化超氧化物歧化和过氧化物氧化的反应速度加快，从而降低体内活性氧的浓度，达到减轻植物体内因高温胁迫产生的氧化反应对植物细胞造成损伤的影响。因此，用相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量等指标来衡量植物高温胁迫受害程度有理论依据，对提高丝瓜遗传育种与产量、质量有重要现实意义。

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