戴尔沃牛奶抗生素检测试剂盒灵敏度验证及操作注意事项

贾洪川，魏华威，姚 华

1 北京农学院动物科学技术学院，北京昌平区 102206

2 北京优尼赛斯科技有限公司，北京朝阳区 100024

3 中华人民共和国北京海关，北京朝阳区 100006

0 引言

在奶牛养殖过程中，抗生素用于牛只疾病预防及治疗，使用频繁[1]。原奶中抗生素残留既会对人类健康产生不利影响，也会让奶牛产生抗生素耐药性，增加疾病治疗的难度等[2～4]。戴尔沃牛奶抗生素检测试剂盒（Delvotest SP NT）是目前在奶牛养殖基层原奶抗生素残留检测应用最普遍的方法之一，该方法采用嗜热芽孢杆菌抑制法，是国际抗生素残留检测的“金标准”[5]。其原理是培养基微孔中预先混合好嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，并含有pH指示剂（溴甲酚紫），加入样品并在64℃左右孵育，若样品中不含有抗生素或者抗生素浓度低于检出限，细菌芽孢在培养基中生长不受抑制，并利用糖产生酸，pH指示剂则会由紫色变成黄色。相反，如果加入的样品含有抗生素或抗生素浓度高于检出限，则细菌生长受抑制，培养基不会变色，仍为紫色[6]。本文参照牛乳中兽药残留国家要求[7]，对Delvotest SP NT灵敏度进行了验证试验。

1 试验设备与材料

1.1 试验设备

10μL、100μL和1L的移液枪头及配套移液器，（64±2）℃恒温水浴锅或金属温育器，0.01g电子秤，100mL量筒，5mL一次性离心管。

1.2 试验材料

Delvotest SP NT：批次17B20A35，青霉素G、头孢氨苄、林可霉素各1mg/kg浓度的标准品，脱脂牛乳粉，纯净水。

2 试验步骤

2.1 脱脂乳的配置

使用离心管称取1g脱脂牛乳分粉，然后加入9mL纯净水，混匀备用。

2.2 样本制备

吸取10μL青霉素G标品，加入990μL脱脂乳中，100.0倍稀释，得到10μg/kg青霉素G的稀释液，然后再进行2.5倍稀释得到4μg/kg青霉素浓度的脱脂乳样品。参考国家限量要求，方法同上，稀释不同倍数，分别得到如表1浓度样品。

表1 样品加标浓度

2.3 操作步骤

2.3.1 从冰箱取出试剂盒，恢复10～20min，至室温。

2.3.2 每个样品做双平行，取出检测试剂微孔板，按照相应数量，使用壁纸刀沿线切开密封铝箔。去掉铝箔膜后，分别加入100μg/kg样品，用试剂盒内封口膜封好微孔。

2.3.3 将样品放入设定好温度（64±2）℃的金属温育器中。

2.3.4 等待2.75h和3.00h后，分别观察微孔颜色变化。

3 验证结果

试验结果见表2，图1、2。

表2 试验结果

图1 2.75 h颜色变化情况

图1 3.00h颜色变化情况

4 结论

4.1 试剂盒灵敏度良好

青霉素G、头孢氨苄、林可霉素三类抗生素均能在国家限量要求内检测阳性。

4.2 检测时间

3.00h固定时间较2.75h的检出限灵敏度降低，可以看到最后2个微孔，在3.00h固定时间较建议时间略有显黄色，是因为含林可霉素150μg/kg浓度样品，其接近试剂盒的检出限。

5 小结

Delvotest SP NT试剂盒具有操作简单，成本低，灵敏度高，检测抗生素种类多等优点，是目前牧场兽药残留检测实用的的检测方法。根据试剂盒的检测原理，在牧场应用过程中，可以选择青霉素G加标4μg/kg和阴性奶样进行验证。

6 注意事项

6.1 正确运输及储藏

Delvotest SP NT试试剂盒应冷藏运输，在2～8℃之间储存，储存时避免冷冻，尽量减少试剂盒与冰箱壁接触，避免冰箱壁冷冻结霜；避免强阳光直射，远离紫外线杀菌设备，保护好细菌芽孢活性。

6.2 正确操作

使用前恢复室温，从冰箱取出后将试剂微孔立即放到高温的温育器中，会导致微孔中细菌芽孢失活。另外不能破坏试剂微孔的密封性，尽量使用壁纸刀切割微孔密封铝箔，密封性破坏后培养基会出现风干现象；使用温育器或者水浴锅时确保温度恒定，温度波动会影响芽孢正常生长。因为试剂盒灵敏度较高，操作时应及时更换吸头，化验员注意佩戴手套，避免污染样本。

6.3 异常情况

受异常乳的影响，样品pH值发生变化（含碱或者酸化），会直接影响试剂的变色反应；另外初乳中含有抑菌物质[8]，检测牛初乳可能会出现假阳性。

6.4 样本选取

操作时，建议做双平行样，并进行阴性质控样本对照试验。出现平行样本不平行时，可以重新试验；样品变色不明显时，对照阴性质控样颜色变化及时间。