菌落PCR 在高中生物学实验中的应用*

章熙东 （南京外国语学校 江苏南京 210008）

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）是一种快速、特异性扩增某特定片段DNA 的分子生物学技术，在生命科学研究中有广泛的应用，尤其在2020 年新型冠状病毒检测中以“快速、准确、高效”的筛选出新型冠状肺炎患者突显PCR 的技术魅力[1]。在高中生物学教学中，PCR 属于选择性必修模块3《生物技术与工程》中“基因工程”教学的一部分，可用于“提取目的基因和扩增目的基因”，其理论基础涉及必修2《遗传与进化》“DNA 结构与复制”等内容。《普通高中生物学课程标准（2017 年版）》明确指出，在帮助学生达成“基因工程赋予生物新的遗传特性”大概念的理解时，应通过开展“PCR 扩增DNA 片段并完成电泳鉴定”，促进学生生物学学科核心素养的提升。因此，高中阶段开展PCR 实验，利于培养学生结构与功能观、物质与能量观等生命观念，利于学生在设计实验、操作实验中提升科学思维品质和科学探究能力，利于在对新冠肺炎疫情等社会热点议题讨论中培养社会责任。但在实际教学中，由于仪器的缺乏，PCR 技术的教学还是浮于纸面。即使有PCR仪，由于实验成本较高，操作过程复杂，实验时间长，往往仅让学生参观仪器，而让PCR 仪成为摆设。“重理论，轻实践；重解题，轻技术”的现象没有得到改变。因此，将菌落PCR 引入高中课堂，能降低成本、缩短时间，让PCR 实验真正走入高中课堂，让学生亲历实验过程，掌握PCR 技术，发展生物学学科核心素养。

基于真实情境下的问题解决能力的培养更利于培养学生的创新精神，因此，面对“土壤磷元素缺乏，影响农业生产”的世界性问题，提高土壤中有效磷元素的含量是科学家迫切想要解决的问题之一。土壤中难溶性磷的转化依赖于一类解磷菌的微生物[2]（主要为细菌），因此，通过项目式学习，带领学生分离纯化并鉴定土壤中的解磷菌，具有重要的社会意义。同时，让学生在问题解决中习得知识，掌握技术，培养能力，是新课程理念所倡导的教学方式。

1 菌落PCR

菌落PCR（colony PCR）可不必提取目的基因DNA，不必酶切鉴定，直接以菌体热解后暴露的DNA 为模板进行PCR 扩增，省时省力，常应用于快速鉴定菌落是否为含目的基因的阳性菌落。与普通DNA 的PCR 相比，菌落易获得，少了提取目的基因步骤而省时，也因不必购买目的基因，一般中学实验室就可操作。而且，可与“微生物的分离与培养”实验专题相衔接，教学设计时可作为1 个单元的整体化设计。

2 实验过程及结果

2.1 菌落获得 本实验采用的菌落为在“微生物的分离与培养”实验中，校园“寻找高效解磷菌，缓解土壤缺磷”的项目式学习的学生从校园土壤中所分离出的解磷菌菌落[3]。挑选了解磷圈较大较明显的菌落（图1），用于PCR 和菌种鉴定。

图1 出现解磷圈的菌落

2.2 菌落PCR

1）制备菌悬液：用高压蒸汽灭菌过的无菌牙签挑取解磷菌的单个菌落，置于20μL ddH2O 中搅拌，将装有20μL ddH2O 的PCR 管在100 ℃下煮2 min，冷却后成为菌悬液。

2）设计引物：采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行菌落PCR，引物序列为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

3）扩增体系：扩增体系20 μL，Fast PCR Master Mix 体系（TaKaRa）10μL，引物27F 与引物1492R 各1μL，菌悬液1μL，ddH2O 7μL（菌悬液与ddH2O 加入量视菌悬液浓度及时调整）。

4）菌落PCR 反应条件设定：94℃预变性1 min；98℃变性5 s，55℃退火5s，72℃延伸20 s，变性退火延伸共30 个循环；循环结束后，72℃保温10 min（使延伸更充分）（图2）；4 ℃保存。

图2 PCR 参数设置

5）PCR仪器扩增。Bio-Rad PCR仪T100，96孔。

2.3 凝胶电泳 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。DNA 分子带有负电，在电场的作用下，DNA 分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。利用DNA 样品分子本身的大小，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现不同大小DNA 分子的分离。琼脂糖凝胶电泳技术可用于对PCR 扩增成功与否进行鉴定，从而为后续的基因测序提供保证。

1）制胶：PCR 扩增期间，配制1%琼脂糖凝胶。称取1 g 琼脂糖加入至100 mL 1×TAE 缓冲液中，微波加热溶解；溶解后加入GelRed 核酸染料，倒入制胶板中，置于室温下待凝固（约20 min）。

2）点样：取5 μL 扩增产物与上样缓冲液混合，将混合液点样至1%琼脂糖凝胶中。

3）电泳：120 V 电压下电泳15 min。

4）观察：将电泳后的琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统进行PCR 产物检测，确认条带并拍照（图3）。将剩余PCR 产物送至测序公司进行测序。

2.4 实验结果 电泳结果显示，所有菌落扩增后在1 465 bp 处均出现单一条带（图3），说明在所取菌落中都能扩增出作为细菌身份的16S rRNA 基因，后续选择清晰明显条带所对应的PCR 产物送至基因公司进行测序，根据结果构建系统发育树，确定所分离出的菌落各属于何种细菌。

图3 菌落PCR 电泳图

3 实验时间分配

本实验利用连续2 节课的时间（约80 min），完成PCR 和电泳实验。具体时间分配见表1。实验操作约55 min，其他时间用于理论指导、结果观察、课堂小结等。

表1 时间安排

4 教学反思

4.1 重时间有效管理，助实验有序进行 利用仪器进行PCR 的时间进行制胶。在仪器配置上，PCR 仪选择96 孔为宜，且较好品牌仪器升、降温速度较快，节约实验时间。选用生物公司专门用于进行菌落PCR 的试剂盒（Fast PCR Master Mix），其包含的Taq 酶高效（延伸速度为10 s/kb），可缩短PCR 中各阶段的反应时间，在30 min 内完成PCR 扩增，与普通PCR 相比，所用时间缩短一半。制胶板选择双排，一排25 孔，总共可上50 个样，保证让每个学生能进行点样操作。优化后的实验，能在55 min 内完成PCR 和电泳实验。

4.2 重关键能力培养，促学科素养提升 在进行菌落PCR 的实验中，培养学生的分子生物学中的关键能力，符合“教学过程重实践”的新课程理念。在PCR 教学中，不只追求学会操作仪器，更应注重学生思维品质的提升，引发学生对“为什么要进行PCR、如何进行PCR、如何解读PCR 结果”等问题的深度思考。

1）为什么要进行PCR？在本实验中，基于“分离出高效解磷菌以解决土壤有效磷含量低”的现实问题情境，通过技术手段分离出高效解磷菌形成菌落后，需对其进行种属的分子鉴定以确定其系统发育地位，势必要对解磷菌的DNA 进行测序。由于Sanger 测序需要足够浓度的DNA，因此，在测序前会先进行PCR 扩增目的基因。如果只需要做定性检测，菌落PCR 能得到与常规PCR 相同的结果，且可节省大量的人力、物力和财力，因此，本实验选用菌落PCR。

2）如何进行PCR？PCR 过程由PCR 仪器完成，难点在于需实验者构建PCR 反应体系。例如，模板的选择、引物的设计、温度的控制等，都是技术要点。

模板的选择：在本实验中，细菌主要存在3 种核糖体RNA（5S、16S、23S rRNA），因16S rRNA 基因有一段高度保守的序列，并且中间的高变区序列是每种细菌独一无二的标记，因而设计引物扩增16S rRNA 基因这一段高度保守的序列。即“16S rRNA 基因”相当于细菌的“身份证”，必须先拿到身份证才能进行进一步的鉴别，所以应先将其扩增再进行序列的比对。

引物的设计：PCR 的成功与否与引物的选择有关，设计引物的能力体现学生掌握PCR 的技术素养。针对引物的设计，如果所要扩增的目的基因在文献中没有报道研究，则需要研究者利用引物设计网站自行设计引物，常用的引物设计网站有Primer blast、Primer Premier 5.0、Primer 3 Plus 等。如果该目的基因在文献中已有报道研究，则可从文献查到该目的基因成熟的引物序列。本研究中学生通过查找阅读大量文献，选择16S rRNA 基因的通用引物[4]。

体系的构建：反应体系的量根据需求而定。本实验选用20 μL 的总反应体系，使用商品化的Fast PCR Master Mix（其中包含Taq 酶、dNTP 和缓冲液），其用量及PCR 仪器参数的设置参照说明书；在20 μL 的总反应体系中加入上、下游引物各1 μL；本实验中加入1 μL 菌液作为模板。

3）PCR 电泳结果的解读：PCR 扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶上点样已知条带大小的标准样（DNA Marker），方便比对扩增产物的分子量大小。根据琼脂糖凝胶电泳的结果选择条带较亮（产物较多）的样品送去测序。最终将测序结果与Genebank 数据库中序列进行比对，确定菌种的系统发育位置。

以实践活动为学习起点，以问题解决为终点，学生从学习实验原理，到进行实验操作，感受解决问题的快乐，从中提升综合能力。