化学发光联合免疫组化技术对不同类型子宫内膜异位症的鉴别诊断

柳燕飞，刘雯雯，郭蕾，张艺，高天旸

(广东省第二人民医院，广东 广州 510317)

子宫内膜异位症(EMT)是诱发不孕不育以及盆腔疾病等的常见病因，异位宫颈内皮细胞具有多位置定植的特点，其中卵巢型EMT、深部浸润EMT以及腹膜型EMT的发生率最高，且危害性较大[1]。目前EMT仍缺乏有效的治疗药物，传统的诊断主要采用影像学诊断及免疫组化技术，这些方法存在诊断时间长、深部组织干扰大以及血清指标(如癌胚抗原125)可变性大等缺陷[2]。随着EMT研究的不断深入，研究者发现可通过免疫因子、血管新生以及血清炎症因子水平鉴别EMT，但对于不同异位部位EMT的鉴别仍缺乏可靠指标[3]。基于上述问题，本研究选择免疫组化联合磁珠化学发光方法，对卵巢型EMT、深部浸润EMT以及腹膜型EMT实施生物学诊断研究。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年2月—2020年2月我院收治的90 例患有不同类型子宫内膜异位症患者为研究对象，经B超及内镜检测，依据患病部位不同将其分为卵巢子宫内膜异位症(A组，30 例)、深部子宫内膜异位症(B组，30 例)、腹壁切口子宫内膜异位症(C组，30 例)，所有患者术前1个月均无激素治疗史。A组，年龄(32.3±4.16) 岁；按子宫内膜异位症分期标准(R-AFS)，Ⅱ期24 例，Ⅲ期6 例；病程(2.12±0.43) 周。B组，年龄(32.84±3.67) 岁；R-AFS分期Ⅱ期25 例，Ⅲ期5 例；病程(2.23±0.46) 周。C组，年龄(32.67±3.33) 岁；R-AFS分期Ⅱ期26 例，Ⅲ期4 例；病程(2.34±0.52) 周。三组患者在年龄、R-AFS分期占比及病程方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：经B超、内镜及手术切除检测均符合《妇产科学》(第8版)关于子宫内膜异位症临床判定标准；无其他宫颈并发症(如宫颈肌瘤等)；无其他脏器如肝脏、心脏及肾脏等系统性疾病；经R-AFS分期评估为Ⅱ期或Ⅲ期。排除标准：患者有其他宫颈疾病并发症或宫颈恶性肿瘤等；患有精神障碍性疾病或沟通障碍性疾病；患者及家属对治疗不知情或未签订知情同意书；患者已绝经或处于哺乳期。

1.3 检测方法

所有患者在内镜及影像学诊断辅助下，行外科手术治疗及异位子宫病灶组织采集，病灶面积为0.5～1 cm2，严格分离患部及周围组织。采集分离病灶给予编号，并严格执行我院链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)进行免疫组化染色，一抗分别为兔抗人CD4+CD25+Treg抗体、兔抗人Foxp3抗体(ab4728，Abcam)、血管紧张素Ⅱ受体-1(AT1R)(ab124505)及兔抗人血管内皮生长因子(VEGF)抗体(ab42802，Abcam)，每例患者重新检测一次，经4 ℃过夜；二抗为Biotin标记的羊抗兔抗体(A0277，上海碧云天生物技术有限公司)，封闭孵育后加入相同生物素标记的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育30 min后加入SABC显色剂(武汉博士德生物公司)，并于倒置显微镜下进行显色观察，加入显色剂10 min后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)及去离子水洗，晾干加入Harris苏木素核染10 s，之后水洗并封片。患者接受治疗期间同步进行血清采集，用无抗凝剂的采样器抽外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min后，吸取上层血清分装为两管并做好标记，一管置于-80 ℃冰箱保存，另一管进行化学发光法免疫学检测，测定项目包括雌二醇(E2)(安图生物)、血清卵泡刺激素(FSH)(西门子医学诊断产品上海分公司)、黄体生成素(LH)(安图生物)及腹腔积液内层粘连蛋白(LN)(天津博奥赛斯生物科技有限公司)。各种抗体的化学发光检测步骤均严格依照说明书执行。

1.4 评价指标

比较不同类型子宫内膜异位症患者的Foxp3，CD4+CD25+Treg，VEGF及AT1R阳性表达率。染色细胞质或细胞膜呈棕黄色为阳性，阳性表达率=阳性例数/总例数×100%。比较不同类型子宫内膜异位症患者E2，FSH，LH及LN水平变化。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 不同类型子宫内膜异位症中Foxp3和CD4+CD25+Treg表达率比较

C组Foxp3及CD4+CD25+Treg阳性表达率显著低于其余两组(P<0.05)，其中A组的阳性率最高；C组AT1R的阳性表达率显著高于其余两组(P<0.05)；B组VEGF的阳性表达率显著高于其余两组(P<0.05)(见表1)。

表1 不同EMTs中Foxp3和CD4+CD25+Treg表达率比较 例(%)

2.2 不同类型子宫内膜异位症患者各项指标比较

B组E2水平显著高于其余两组(P<0.05)；A组的FSH水平显著低于其余两组(P<0.05)，同时A组的LH水平显著高于其余两组(P<0.05)；C组的LN水平显著低于其余两组(P<0.05)，其中B组的LN水平最高(见表2)。

表2 不同类型子宫内膜异位症患者各项检查指标比较

3 讨 论

子宫内膜异位症是子宫内膜活体组织(如腺体细胞等)定植于宫颈外不同组织并浸润生长诱发的一种疾病[4]。研究[5-6]发现，机体对异位细胞产生免疫耐受是EMT发生的主要原因。章舒等[5]证实淋巴T细胞调节基因Foxp3启动了T调节细胞的免疫抑制，从而导致异位细胞无法被机体免疫清除而诱发异位生长，除此之外，异位细胞生长中新生血管的产生是异位生长细胞营养供应的主要来源。有研究[7]证实，除免疫耐受外，外科剖宫产手术容易诱发腹壁型EMT。钟文萱等[7]采用免疫组化检测腹壁异位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织AT1R与血管紧张素Ⅱ受体-2(AT2R)蛋白的表达，结果显示，与正常子宫内膜组织相比，腹壁型EMT患者子宫内膜组织的AT1R呈强阳性表达。目前主要采用化学发光技术及酶联免疫反应检测血清VEGF，LN及E2等以监测EMT的发病部位[8-9]。但是，因为这些标记物在血清或腹腔积液中具有可变性，同时深部浸润型EMT的生物学检测报道较少，因此仍需进一步深入研究。本研究基于国内外相关报道，从免疫调节及血管新生角度对不同生物分子在不同类型EMT中的表达进行研究，结果显示A组Foxp3及CD4+CD25+Treg的阳性表达率显著高于其余两组(P<0.05)，初步说明免疫抑制调节对卵巢型EMT的发生起重要作用。C组AT1R阳性率显著高于其余两组(P<0.05)，初步说明AT1R对腹壁型EMT的发生有重要作用。B组VEGF阳性率显著高于其余两组(P<0.05)，初步说明深部浸润型EMT患者的发生过程中VEGF起关键作用。子宫内膜腺体细胞是分泌E2的重要细胞，因此E2水平监测对深部浸润型EMT患者的鉴定具有重要辅助价值。本研究B组的E2水平显著高于其余两组(P<0.05)。A组的FSH水平显著低于其余两组(P<0.05)，同时A组的LH水平显著高于其余两组(P<0.05)，说明了卵巢型EMT患者由于异位细胞生长，可抑制FSH的分泌，间接解决了黄体抑制排卵导致的不孕不育。C组的LN水平显著低于其余两组(P<0.05)，说明内层腹腔积液粘连细胞在深部浸润型EMT中呈现高表达。

综上所述，在目前缺乏特定性生物标记分子的条件下，可通过多项技术的联合对不同类型子宫内膜异位症进行鉴别，同时联合检测Foxp3，CD4+CD25+Treg，LH，E2，LN，FSH及AT1R，可有效鉴别不同类型EMT。