叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡及纺锤体组装检查点相关蛋白表达的影响

任欢欢，杨 瑜，徐洪宝，王忠迈，程 宗，梁 猛，王春景，廖亚平

纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint，SAC)是细胞周期调控中的众多检查点之一，有助于维持细胞有丝分裂期间基因组稳定性，SAC结构功能异常是导致染色体不稳定性与非整倍体的重要原因之一，Mad2、Bub1、BubR1是SAC中的关键组分。

叶酸是一碳代谢循环中重要的甲基供体，在DNA合成、稳定性及修复中起关键作用。其缺乏会导致DNA损伤、染色体和基因组不稳定等。叶酸缺乏会对损坏SAC网络，从而致使细胞发生有丝分裂异常与非整倍性[1]，但是非整倍体发生的机制尚不明确且叶酸缺乏对SAC影响的报道较少。本研究通过探索不同浓度叶酸对L02细胞增殖、凋亡及Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平的影响，并讨论可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 L02细胞(武汉普诺赛细胞库)；无叶酸RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco公司)；叶酸粉末(Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI试剂盒、细胞周期试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、PMSF(江苏碧云天生物有限公司)；Mad2、Bub1、BubR1抗体(美国Bethyl公司)；β-actin抗体(Cell Signaling Technology 公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(Takara公司)；Mad2、Bub1、BubR1引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 将L02细胞培养于含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。将细胞分为正常对照组和不同浓度叶酸组(分别给予200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L叶酸处理2周)。

1.2.2 倒置显微镜下观察细胞形态 倒置显微镜下观察不同浓度叶酸培养2周后的L02细胞形态。

1.2.3 CCK8法检测细胞活性 将培养第12天的L02细胞按3.0×103个/孔接种于96孔板，各组3孔，过夜贴壁后，每孔加入10 μL CCK8试剂后置于培养箱中培养2 h，并于450 mm处检测吸光度(OD)值。

1.2.4 细胞周期试剂盒检测细胞周期 将培养2周的L02细胞以5×105个/mL接种于6孔板中，收集细胞；按照说明书进行PI染色，流式细胞仪上机检测。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡 将培养2周的L02细胞以5×105个/mL接种于6孔板中，收集细胞；按照说明书进行Annexin V-FITC/PI进行染色，流式细胞仪上机检测。

1.2.6 qRT-PCR检测Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达量 收集各组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，按照Takara的反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增Mad2、Bub1、BubR1。根据GenBank上公布的人类Mad2、Bub1、BubR1序列，应用Primer Primer5软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成(见表1)。同一标本β-actin作为内参照，采用2-△△CT法进行相对定量分析。qRT-PCR的反应条件:95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，40个循环。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting检测Mad2、Bub1、BubR1的蛋白表达水平 收集各组细胞，用RIPA裂解液进行裂解，BCA蛋白定量后调整蛋白浓度，取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳。电转到PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭室温封闭2 h。室温孵育一抗Mad2、Bub1和BubR1(1∶1 000稀释)1 h，洗膜3次，室温孵育相应二抗1 h，细洗膜3次。ECL显色后置于凝胶成像仪中曝光，Image J进行灰度值分析。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 叶酸对L02细胞形态学的影响 与正常对照组相比，20 nmol/L与0 nmol/L叶酸培养2周后，细胞体积增大、形态不规则，0 nmol/L叶酸组现象更加显著(见图1)。

2.2 叶酸对L02细胞增殖活性的影响 与正常对照组相比，200 nmol/L、20 nmol/L组与0 nmol/L细胞活性明显降低(P<0.01)；与200 nmol/L相比，20 nmol/L与0 nmol/L组细胞活性明显降低(P<0.01)(见表2)。

表2 不同浓度叶酸培养2周后对细胞增殖能力(OD450值)的影响

2.3 叶酸对L02细胞周期的影响 与正常对照组相比，200 nmol/L组细胞G1/G0期、S期均值差异无统计学意义(P>0.05)；20 nmol/L组和0 nmol/L组细胞G1/G0期明显降低(P<0.01)、S期明显升高(P<0.01)。与200 nmol/L相比，20 nmol/L组和0 nmol/L组细胞G1/G0期明显降低(P<0.01)、S期明显升高(P<0.01)。与20 nmol/L组相比，0 nmol/L组S期明显增加、G1/G0期明显减少(P<0.01)(见表3)。

表3 不同浓度叶酸培养2周后对细胞周期的影响

2.4 叶酸对L02细胞凋亡的影响 与正常对照组相比，200 nmol/L组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；20 nmol/L组细胞发生凋亡(P<0.05)，0 nmol/L组细胞明显发生凋亡(P<0.01)。与200 nmol/L相比，20 nmol/L组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，0 nmol/L组凋亡率明显增加(P<0.01)。与20 nmol/L组相比，0 nmol/L组凋亡率明显增加(P<0.01)(见图2、表4)。

表4 不同浓度叶酸培养2周后对细胞凋亡的影响

2.5 叶酸对L02细胞Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达量的影响 与正常对照组相比，叶酸浓度为200 nmol/L时，Bub1 mRNA的表达量增加(P<0.05),Mad2和BubR1 mRNA的表达量明显增加(P<0.01)；叶酸浓度为20 nmol/L及0 nmol/L时，Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达量均明显增加(P<0.01)(见表5)。

表5 不同浓度叶酸培养2周后对SAC相关基因表达的影响

2.6 叶酸对L02细胞Mad2、Bub1、BubR1蛋白表达的影响 与正常对照组相比，200 nmol/L组Bub1蛋白表达量增加(P<0.05)，20 nmol/L、0 nmol/L组Bub1 蛋白表达量明显增加(P<0.01)；200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L组Mad2和 BubR1蛋白表达量均明显增加(P<0.01)(见图3、表6)。

表6 不同浓度叶酸培养2周后对SAC相关蛋白表达的影响

3 讨论

相关实验研究显示[2]叶酸浓度为120 nmol/L时便可维持人淋巴细胞基因组结构稳定，因此本实验选取略高于基因组稳定的叶酸浓度即200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L作为实验组。CCK8结果显示叶酸浓度为200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L时叶酸增殖受到了明显抑制，细胞周期与凋亡结果显示，叶酸浓度为200 nmol/L时，L02细胞G1/G0期、S期及凋亡率均值与正常对照组差异无统计学意义。叶酸浓度为20 nmol/L、0 nmol/L 细胞发生S期阻滞，凋亡数量增多，且叶酸浓度越低S期阻滞越明显、细胞凋亡数量越多。COURTEMANCHE等[3]的研究显示叶酸缺乏可以降低细胞增殖，诱导凋亡和细胞周期阻滞，本研究与上述研究结果相符合。LIANG等[4-5]研究表明叶酸缺乏诱导细胞发生G1/G0期阻滞，从而导致细胞发生凋亡，在G1/G0期阻滞与凋亡之间建立了联系。HUANG等[6]研究结果显示在叶酸缺乏的培养基中HepG2细胞叶酸浓度较低，细胞在S期积累随后发生G2/M期阻滞，进而诱导细胞发生凋亡。低叶酸缺诱导的DNA的损伤程度具有凋亡反应，这是叶酸缺乏引起细胞凋亡的原因之一。本研究中，当叶酸浓度为20 nmol/L、0 nmol/L时细胞发生S期阻滞，进而诱导细胞发生凋亡。本研究与上述研究结果有所不同，本研究结果显示叶酸缺乏时细胞发生S期阻滞，我们认为差生差异的原因可能是由于所用细胞系、培养细胞时间不同造成的。

SAC作为细胞周期检查点对于维持细胞周期正常进行至关重要，Bub1参与染色体排列，Mad2和BubR1通过结合底物CDC20，阻止CDC20激活APC/C以达到抑制APC/C的效果，防止细胞提前进入后期。SAC作为细胞周期的监控机制，其某些成分的异常表达会使SAC功能发生改变，导致染色体不稳定和非整倍体。对果蝇和小鼠的研究均证实了SAC在维持染色体稳定方面的重要性[7-11]，在SAC发生突变的细胞中，有丝分裂错误的发生率很高，导致非整倍体细胞的比例急剧增加[11-12]。在一项宫颈癌研究中[13]发现，下调Mad2和BubR1可以促进SiHa细胞增长，增强细胞侵袭和迁移能力，抑制细胞凋亡，降低药物治疗作用[13]。并且下调Mad2可以通过调控磷酸化survivin的活化，调控胃癌细胞周期，增加增殖，提高胃癌细胞的耐药性[14]。另一项对乳腺癌研究[15]中，与KrasG12D或Her2同时在成年小鼠乳腺中过表达有丝分裂检查点蛋白Mad2，会导致有丝分裂检查点过度激活，过早的Mad2表达会导致强烈的有丝分裂停止和细胞死亡增加。用特异性的小干扰RNA敲低纺锤体检查点蛋白BubR1或Mad2，可显著减少6,7-二甲氧基-3-(3-甲氧基苯基)异喹啉-1-胺(CWJ-082)诱导的有丝分裂细胞积累和凋亡[16]。印度的一项药物研究[17]也显示，过表达的Mad2通过恢复适当的后期启动和维持更多的细胞存活，部分地挽救了药物的有害作用。在肝细胞性癌组织和细胞中，miR-490-5p的过表达或Bub1的过表达抑制了肝细胞性癌细胞的增殖、迁移、侵袭，增加了凋亡率[18]。缺少Bub1的小鼠胚胎成纤维细胞不能使其染色体对齐或维持SAC功能[19]。本研究结果显示，叶酸浓度为200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L时Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达量明显增加，Western blotting检测也显示在蛋白水平上Mad2、Bub1、BubR1表达量明显增加。

结合上述研究和实验结果我们得出这样一个结论：对于SAC来说叶酸浓度为200 nmol/L已经达到一种缺乏状态，Mad2、Bub1、BubR1的高表达用于增加SAC的活性，可以维持细胞有丝分裂进行，避免细胞发生凋亡。当叶酸极度缺乏时(20 nmol/L和0 nmol/L)，SAC功能活性受到了严重损害，Mad2、Bub1、BubR1的高表达不足以维持其正常活性，有丝分裂出现异常，可能导致非整倍体及染色体不稳定的发生，使得细胞增殖受到抑制，细胞周期发生阻滞，诱导细胞发生凋亡。综上所述，本研究结果显示，对于L02细胞来说叶酸浓度为200 nmol/L时已经达到一种缺乏状态，叶酸缺乏时SAC功能异常，可能是阻碍细胞增殖、诱导凋亡的原因。