蓝藻有机富硒肥的研制及其在普通白菜种植中的应用
2021-06-30 02:23斯鑫鑫唐尙柱赵晓海王顺永李玉成
江苏农业学报 2021年2期
关键词：蓝藻
斯鑫鑫 唐尙柱 赵晓海 王顺永 李玉成
摘要： 為了研究蓝藻与农业废弃物无害化处理及资源化利用技术，开展蓝藻、菌渣、稻壳混合富硒堆肥试验，设置对照组（CK）、富硒枯草芽孢杆菌组（W）、亚硒酸钠组（Y）研究不同硒处理对蓝藻好氧堆肥的影响。结果表明，堆制48 d后，各处理的堆肥均已满足有机肥料国家标准（NY 525-2012《有机肥料》）的要求，pH值均维持在5.5～8.5，种子发芽指数均高于85.00%，W处理组的有机质含量分别较CK、Y处理组提高了8.72%、9.13%，总养分（N+P2O5+K2O）含量分别较CK、Y处理组提高了5.60%、4.70%，总硒含量分别较CK、Y处理组提高了1.92倍、0.21倍。盆栽试验结果表明，W、Y处理组的普通白菜株高、根长、单株鲜质量均显著高于对照组（P<0.05），与对照组相比，W、Y处理组的总硒含量分别提高了127.73%、112.53%，有机硒含量分别提高了135.45%、102.73%，此外，施加硒肥减少了普通白菜体内铅、镉的累积量。综合考虑2种硒处理对蓝藻堆肥的影响得出，富硒枯草芽孢杆菌处理的堆肥效果相对更好。
关键词： 蓝藻;富硒枯草芽孢杆菌;好氧堆肥;普通白菜
中图分类号： X52;S141.4 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）02-0340-08
Abstract： To study the technology of harmless treatment and resource utilization of cyanobacteria and agricultural wastes， experiment of selenium enriched composting using mixture of cyanobacteria， mushroom residue and rice husk was carried out. Groups of control （CK）， selenium-enriched Bacillus subtilis （W） and sodium selenite （Y） were set up to study the effects of different selenium treatments on cyanobacteria aerobic composting. The results showed that， after 48 days of composting， the finished compost of each treatment met the requirements of the national standard for organic fertilizer （NY 525-2012
Key words： cyanobacteria;selenium-enriched Bacillus subtilis;aerobic composting;bok choy
近年来，随着巢湖流域周边人口的增加以及工农业的迅速发展，导致水体富营养化加剧，巢湖蓝藻水华暴发[1]。目前，处理蓝藻最直接、最有效的措施是传统的机械和人工打捞[2]。打捞上来的蓝藻堆置在湖边或填埋场，经过雨水冲刷，容易使土壤、水体受到污染，并且蓝藻中释放的微囊藻毒素的性质极其稳定，是一种能引发肝功能失调甚至肝癌的毒素[3]。因此，将蓝藻废弃物进行资源化、无害化处理具有重大意义，其中厌氧发酵、好氧堆肥是治理蓝藻污染的主要技术。好氧堆肥相较于厌氧发酵具有周期短、成本低、操作简单等特点，在前期的工作中，笔者所在实验室进行了蓝藻好氧堆肥降解藻毒素的研究，结果表明，堆肥中微囊藻毒素LR（MC-LR）、微囊藻毒素RR（MC-RR）含量均低于1 μg/kg，降解率达95%[4]，说明通过好氧堆肥能够有效消除蓝藻中的藻毒素。同时，蓝藻中含有大量营养物质，利用好氧堆肥能够生产出优质的有机肥料，实现蓝藻的资源化利用。由于蓝藻的碳氮比较低，需要结合其他物料来调节堆肥材料参数。农业废弃物中含有作物生长所需的养分，因此将蓝藻与农业废弃物进行混合堆肥不仅可以减少环境污染，还可充分利用有机物资源，有利于农业的可持续发展。
随着有机农业的发展及人们生活水平的提高，发展功能农业是未来发展的方向。硒是人体必不可少的微量元素之一，具有抗氧化、防癌治病等生理功能[5]。研究发现，中国约有72%地区的人口硒摄入量不足，严重影响了人们的身体健康[6]。近年来，关于无机富硒肥的研究颇多，但是摄入过多的无机硒会影响人们的身体健康，还会抑制作物生长和污染环境，导致作物产量和品质下降。有机富硒肥料作为土壤改良剂，在培养富硒作物方面利用率高，效果显著[5]。由此可见，有机富硒肥料的研制是生产富硒有机农产品的一条有效途径。
以往研究富硒有机肥的原材料大都是畜禽粪便或其他农业废弃物，利用蓝藻生产有机富硒肥的研究甚少。本试验通过在堆肥材料中接种富硒枯草芽孢杆菌、添加亚硒酸钠制作蓝藻有机富硒肥，以蓝藻、菌渣、稻壳为原料进行混合堆肥，通过调节堆肥材料水分含量及碳氮比进行堆肥试验，探究不同硒处理对蓝藻堆肥效果的影响。由于普通白菜是常见的十字花科蔬菜，是人体补硒的理想硒源，且其生长周期短，适于四季栽种，易于大规模生产，因此本研究通过普通白菜盆栽试验，分析蓝藻有机富硒堆肥对普通白菜生长及硒含量的影响，以期为蓝藻有机富硒肥料在生产实践中的应用提供理论依据，同时使农业废弃物实现资源化利用，发展循环农业。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本研究所用普通白菜品种为四季青。堆肥试验所用蓝藻采用安徽省合肥市巢湖岸边晒干的蓝藻藻泥，食用菌菌渣取自合肥立新菌种厂培训学校，水稻稻壳取自紫蓬山试验基地，亚硒酸钠（分析纯试剂）购自合肥拜尔迪化学科技有限公司，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。堆肥原料的基本理化性质见表1。
1.2 堆肥试验
1.2.1 富硒枯草芽孢杆菌的制备 B. subtilis用LB液体培养基培养，分别向培养基中添加0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L、60 mg/L、90 mg/L Na2SeO3和体积分数为2%、4%、6%的枯草芽孢杆菌菌液（浓度为1×108CFU/ml）。利用B. subtilis 的生物转化能力将有毒、利用率低的Na2SeO3转化为吸收率高且安全性好的有机硒，在培养B. subtilis的过程中通过添加不同质量浓度的Na2SeO3及使用不同菌种接种量，探究在不同加硒条件下B. subtilis的富集转化和生长情况。结果显示，培养B. subtilis的最适Na2SeO3质量浓度、接种量分别为30mg/L、4%，在最优条件下B. subtilis对无机硒的转化率達到80.57%。
B. subtilis对无机硒转化率影响的测定[7]。将培养好的B. subtilis菌液于10 000 r/min离心10 min，取3.0 ml上清液，向其中加入1.5 ml 4 mol/L HCl和3.0 ml 1 mol/L抗坏血酸，上下摇晃使其充分反应，在室温下反应10 min后于500 nm处测定其吸光度。将所测吸光度代入标准曲线方程Y=0.003 2x-0.004 3（R2=0.996 7，x：亚硒酸钠质量浓度;Y：吸光度），计算残留的无机硒质量浓度，进而可以得出B. subtilis对无机硒转化率。
1.2.2 堆肥试验 将蓝藻、菌渣、稻壳按1∶10∶1的质量比混匀后，调节含水率为60%左右，调节碳氮比至22左右，再将其装入30 L自制的堆肥桶中，在堆肥桶中央和底部均钻洞以插入打过孔的聚氯乙烯（PVC）管并用弯头连接，在堆肥桶底部安装有鼓风机，以保证氧气的正常供给。试验设置1个对照组（CK）和2个处理组，处理组分别接种富硒枯草芽孢杆菌（W）和加入相同质量浓度的亚硒酸钠（Y），每个试验组设2个平行，每3 d鼓风1次，每10 d翻堆1次，每次翻堆视堆体含水情况补充适量水分。
1.2.3 采样时间与方法 从堆肥当天开始每天将堆肥发酵专用测温计插入堆体中部，读取堆体温度，同时记录环境温度。取样时间分别为堆肥后第1 d、第6 d、第11 d、第19 d、第28 d、第38 d、第48 d，采样时，将每个样品分为风干样、新鲜样，风干样用于测定pH值、总有机碳（TOC）含量、总氮含量、总磷含量、总钾含量、总硒含量及不同形态硒的含量，新鲜样用于测定种子发芽率。
1.2.4 测定方法 pH值的测定：称取2.0 g过20目筛的堆肥样品于50 ml离心管中，加入20 ml纯水，恒温振荡25 min，静置30 min后，用pH计测定试样上清液的pH值。总氮含量、总磷含量、总钾含量的测定参照NY 525-2012《有机肥料》[8]，总有机碳含量采用重铬酸钾外加热法测定。
种子发芽指数（GI）的测定[9]：取5 kg新鲜堆肥样品，以蒸馏水为溶剂，按1 g∶10 ml的固液比浸提鲜样。取10 ml浸提液放入铺好滤纸的无菌培养皿中，点播20粒叶用莴苣种子（主要通过测试种子发芽率来评价堆肥产品是否腐熟及其毒性），每个处理设3次重复，同时设清水对照。培养皿置于25 ℃恒温培养箱中培养60 h后测定种子发芽率及根长。GI的计算公式如下：
GI=（堆肥处理的种子发芽率×种子根长）/（对照处理的种子发芽率×种子根长）×100%
总硒含量及不同形态硒含量的测定：用HNO3-HClO4溶液（体积比为3∶2）于170 ℃消解后测定总硒含量[10]。硒形态的测定主要参考瞿建国等[11]的连续浸提法，准确称取1.0 g过100目的风干样品置于50 ml离心管中，按固液比1 g∶10 ml逐级加入浸提液进行连续浸提。
1.3 盆栽试验
试验用盆（长42.5 cm，宽18.5 cm，高13.0 cm）为聚丙烯（PP）树脂材质，每盆装3.0 kg土（供试土壤采自安徽省合肥市紫蓬山试验基地），将发酵腐熟的有机富硒肥与土壤按质量比1∶3混合使用，当天将土肥浇透水，隔天种植浸泡5 h的普通白菜种子[12-13]，每盆播种大小基本一致的饱满种子20粒。试验共设3个处理：（1）施堆肥CK组;（2）施堆肥W组;（3）施堆肥Y组，每个处理设2个重复，试验周期为45 d。
普通白菜生长指标及总硒含量的测定参照宋卫卫[12]的方法，铅、镉含量的测定采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）法。
普通白菜无机硒、有机硒含量的测定[14]：称取1 g样品置于锥形瓶中，加入30 ml超纯水，经超声处理30 min后，于5 000 r/min离心10 min或用定量滤纸过滤，在上清液中加入5 ml环己烷，4 h后收集水相，再将该水相溶液加热2～3 min，用超纯水定容至10 ml容量瓶中后用ICP-MS法测定无机硒含量，有机硒含量=总硒含量-无机硒含量。
1.4 数据分析
用Excel 2013、SPSS 22软件对试验数据进行处理分析，用Origin 2018软件进行绘图分析。
2 结果与分析
2.1 堆制过程中堆肥的理化性质
2.1.1 堆制过程中堆肥温度的变化 温度是评价堆肥是否腐熟的重要指标之一[9]。如图1所示，3个处理的堆肥温度总体呈先升高后降低最后趋于稳定的趋势，其中W处理组的温度在堆肥第11 d达到最高值59.6 ℃，且高温阶段（>50.0 ℃）持续了12 d。而CK、Y处理组的堆肥温度都在堆制第14 d达到最高值，分别为56.4 ℃、56.3 ℃，高温阶段（>50.0 ℃）分别只持续了8 d、10 d。在整个堆制过程中，W处理组的堆肥升温较快且温度较高，说明接种枯草芽孢杆菌能够促进堆肥发酵腐熟，提高堆体温度且延长高温持续时间。
2.1.2 堆制过程中堆肥pH值的变化 pH值是影响堆肥微生物生长繁殖的重要因素之一，同时也是反映堆肥腐熟进程的重要参数。pH值过高或过低都不利于堆肥高温好氧堆肥反应的进行，从而严重影响堆肥腐熟周期及堆肥产品质量[15]。由图2可以看出，在堆制过程中对照及W、Y 2个处理组的pH值均呈先上升后下降的变化趋势，变化范围为7.60～8.40。在堆制过程中，蓝藻堆肥中大量含氮化合物发生氨化作用，促进了NH+4的生成，提高了堆肥pH值。在堆肥后期，氨化作用降低，硝化作用增强，同时大分子有机化合物分解产生的H+使堆肥pH值下降[16]。经48 d的发酵，对照与W、Y处理组的pH值分别为7.75、7.66、7.76，符合堆肥对pH值的要求[8]，说明接种枯草芽孢杆菌可以加快堆肥的发酵腐熟，将更多有机物质转化为有机酸，从而降低堆体的pH值[17]。
2.1.3 堆制过程中堆肥总有机碳含量的变化 从图3可以看出，在堆制过程中，对照组和W、Y 2个处理组的总有机碳含量均呈明显下降的趋势，并且在堆肥升温期和高温期下降幅度最大，可能是因为微生物在这2个阶段易于生长繁殖，降解有机物质的能力增强。堆制第19 d时，CK和W、Y处理组的总有机碳含量分别为277 g/kg、263 g/kg、273 g/kg，与初始含量相比分别下降了58 g/kg、73 g/kg、63 g/kg。随着堆肥反应的进行，总有机碳含量的下降幅度变缓，一方面可能由于微生物在降温、腐熟2个阶段的活性减弱且后期剩下的是难以分解的有机物，另一方面是由于堆肥引起了“浓缩效应”[18]。堆制结束后，CK和W、Y处理组的总有机碳含量分别为264 g/kg、287 g/kg、263 g/kg，相对于堆制初期，损失率分别为21.19%、14.58%、21.73%。经计算，有機质含量分别为45.51%、49.48%、45.34%，均已达到有机肥行业标准[8]。结果显示，堆制28 d时，W处理组的有机质含量分别较对照、Y处理组提高了8.72%、9.13%，说明接种枯草芽孢杆菌能够提高堆肥产品的有机质含量。
2.1.4 堆制过程中堆肥对种子发芽率的影响 GI是评价堆肥产品是否腐熟及其毒性的重要指标之一，可以在一定程度上衡量堆肥效果。相关研究发现，当种子GI>50.00%时，堆肥的毒性较低且在植物可接受的水平;当种子GI>80.00%时，说明堆肥已完全腐熟[19]。
由图4可知，在堆制过程中对照组和W、Y 2个处理组的GI均呈不断上升的趋势，在堆制的前6 d，3组的GI均低于30.00%，堆肥第1 d CK和W、Y处理组的GI分别为20.75%、20.35%、18.65%。随着堆制的进行，堆肥浸提液毒性降低，3组的GI均上升，W处理组的GI最先达到80.00%。堆制结束时，CK和W、Y处理组的GI分别为87.35%、89.3%、87.45%，表明接种枯草芽孢杆菌堆肥的效果更好，有利于加快堆肥腐熟进程。
2.2 堆肥质量评价
根据NY 525-2012《有机肥料》中规定的技术指标，有机肥中的总养分（N+P2O5+K2O）含量（以干基计）应≥5%。从图5可以看出，堆制过程中对照组和W、Y 2个处理组的堆肥总养分含量整体均呈上升趋势，堆制结束时，CK和W、Y处理组的总养分含量分别为5.31%、5.61%、5.36%，均已达到有机肥行业标准[8]。其中，W处理组的总养分含量分别较CK和Y处理组提高了5.60%、4.70%。通过对3组堆肥处理的pH值、种子发芽率及有机质含量、总养分含量进行综合比较得出，接种枯草芽孢杆菌提高了堆肥的品质。
2.3 堆制过程中堆肥总硒含量及硒形态的变化
由图6可以看出，堆制结束时，W、Y处理组的总硒含量分别比对照组提高了1.92倍、1.41倍。在堆制过程中，CK和W、Y处理组的总硒含量整体均呈上升趋势，这可能是由于在堆制过程中有机物分解，CO2、NH3释放及物料水分蒸发所造成的浓缩效应[10]。W处理组的总硒含量整体大于Y处理组，一方面由于接种枯草芽孢杆菌加快了有机物分解，另一方面可能是由于无机硒在适宜条件下被堆体中的微生物转化成二甲基硒[（CH3）2Se]等挥发态硒[20]。
硒按形态可以分为水溶态、可交换态及碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残渣态等，不同形态的硒被植物吸收利用的难易程度也大不相同。由图7可以看出，对照组的有机结合态硒、残渣态硒含量占比在堆制后48 d较堆制后1 d提高，水溶态硒的占比显著降低，铁锰氧化物结合态硒含量所占比例基本不变。W处理组的不同形态硒含量占比在整个堆制过程中变化较小，其中水溶态硒含量占比从堆制起始阶段的9.53%下降到堆制结束时的5.28%，可交换态及碳酸盐结合态硒含量占比由堆制起始阶段的5.88%上升至堆制结束时的8.09%，铁锰氧化物结合态硒含量占比从堆制起始阶段的29.93%上升至堆制结束时的31.88%，有机结合态硒含量占比从堆制起始阶段的37.82%上升至堆制结束时的39.38%，残渣态硒含量占比从堆制起始阶段的16.84%下降至堆制结束时的15.37%。结果表明，通过微生物富集转化而来的有机硒在堆制过程中稳定。从Y处理组硒的各形态来看，堆制结束时的硒以有机结合态为主，占比从堆制起始阶段的21.39%上升至堆制结束时的45.18%，可能由于堆制过程中有机质对硒的吸附与固定作用[21]。水溶态硒含量占比由堆制起始阶段的22.88%下降至堆制结束时的2.91%，可交换态及碳酸盐结合态硒含量占比从堆制起始阶段的6.90%下降至堆制结束时的5.71%，铁锰氧化物结合态硒含量占比从堆制起始階段的35.50%下降到堆制结束时的31.47%，残渣态硒含量占比由堆制起始阶段的13.33%上升至堆制结束时的14.73%，说明添加外源亚硒酸钠改变了堆肥中硒的形态平衡，经过氧化还原作用、微生物生化作用及腐殖化作用完成了不同硒形态间的相互转化[20]。
2.4 不同堆肥对盆栽普通白菜生长的影响
根据植物对硒的吸收累积能力，人们将植物分为聚硒植物、非聚硒植物和富硫且高聚硒植物，而一般农作物累积硒的能力排序为十字花科>黑麦草>豆类>谷类[22]。普通白菜是常见的十字花科植物，且生长周期短，适于四季栽种，可以作为人体补硒的理想硒源，为人体提供有效的生物有机硒[23]。因此，本研究以普通白菜作为研究蓝藻有机富硒肥效果的对象，探究加入不同硒处理的有机肥对普通白菜硒吸收及铅、镉累积的影响。由表2可以看出，W、Y处理组的普通白菜株高分别较对照组提高了13.2%、10.5%;W、Y处理组的普通白菜根长均大于对照组，分别较对照组提高了18.6%、11.7%，其单株鲜质量、单株干质量与对照组相比都有显著差异（P<0.05）。上述生长指标在W、Y这2个处理组间并无显著差异，与殷金岩等[24]的研究结果一致，说明蓝藻有机富硒肥中适量的硒促进了普通白菜生长。
由图8可以看出，与对照组相比，W、Y处理组的普通白菜总硒含量均有所增加，分别较对照组提高了127.73%、112.53%，有机硒含量分别较对照组提高了135.45%、102.73%。结果表明，蓝藻有机富硒肥能够促进普通白菜对硒的吸收富集，显著提高普通白菜体内的总硒、有机硒含量。W处理组的普通白菜总硒、有机硒含量是Y处理组的1.00～1.16倍，说明W处理组的效果更好，这与刘云发等[25]的结果相似，可能是先利用微生物将亚硒酸钠富集转化成有机硒后再堆制成的有机富硒肥更能提高硒的利用率，有助于提高普通白菜体内有机硒含量。施加硒肥减少了普通白菜体内铅、镉的累积量，其中W、Y 处理组镉的累积量分别较对照组减少了51.60%、43.70%，铅的累积量分别较对照组减少了3.90%、24.30%。由此可见，硒对铅、镉表现出拮抗作用，能够缓解重金属铅、镉对普通白菜的胁迫作用，这与张翠翠等[26]的研究结果一致，说明施加硒肥能够有效减少重金属铅、镉在普通白菜体内的累积量。
3 结论
本试验采用蓝藻藻泥和农业废弃物进行混合富硒堆肥试验，在48 d的堆制周期内，各处理堆肥成品均已满足有机肥料国家标准（NY 525-2012《有机肥料》），pH值维持在该标准规定的范围（5.5～8.5），GI高于85.00%，表明堆肥已发酵腐熟。研究结果显示，接种富硒枯草芽孢杆菌有利于提高堆体中的有机质含量、总养分含量、总硒含量，提升有机富硒肥的品质。通过盆栽普通白菜试验可以得出，不同硒处理堆制的有机富硒肥可以促进普通白菜生长，提高普通白菜体内的总硒含量、有机硒含量，并且能够减少铅、镉的累积量。目前生产瓜菜的硒含量需要控制在0.01～0.10 mg/kg[27]，本研究中不同有机富硒肥处理的普通白菜中硒含量均已达标。在堆肥堆制过程中接种富硒枯草芽孢杆菌能提高硒的利用率，从而有效提高普通白菜硒含量及有机硒占比，使生产出来的富硒普通白菜更加安全。
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（责任编辑：徐 艳）
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