天王补心丹对失眠模型鼠的疗效及部分机制研究

刘珊 敬秀平 谢安卫 尹诗

摘要 目的：观察天王补心丹对失眠模型鼠行为学的影响，探析其对TLR4通路的影响。方法：利用氯苯丙氨酸腹腔注射制备失眠模型，将成模45只大鼠数字随机分为模型组、天王补心丹低剂量组（7 g/kg）及天王补心丹高剂量组（28 g/kg），另设空白组15只。连续中药干预7 d后比较各组大鼠旷场行为学、睡眠时间、中缝背核Toll样受体4（TLR4）、髓样分化蛋白88（MyD88）以及外周血清核因子-κB、诱导干扰素β的TRIF变化。结果：天王补心丹可明显减少失眠模型大鼠中央格停留时间、修饰次数，延长睡眠时间缩短睡眠潜伏期，差异有统计学意义（P<0.05），外周血核因子-κB、TRIF、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1以及中缝背核TLR4、MyD88水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：天王补心丹可改善失眠，其作用机制可能与通过TLR4通路调节机体免疫有关。

关键词 失眠;模型大鼠;天王补心丹;行为学;中缝背核Toll样受体4信号通路;关键因子;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-1

Study on the Therapeutic Effect and Partial Mechanism of Tianwang Buxin Pill on Insomnia Model Rats

LIU Shan，JING Xiuping，XIE Anwei，YIN Shi

（General Department，People′s Hospital of Guang′an City of Sichuan Province，Guang′an 638500，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Tianwang Buxin Pill on the behavior of insomnia model rats and to explore its effect on TLR4 pathway.Methods：The insomnia model was established by intraperitoneal injection of chlorophenylalanine.A total of 45 rats were randomly divided into a model group，a low dose Tianwang Buxin Pill group （7 g/kg） and a high dose Tianwang Buxin Pill group （28 g/kg）.Another 15 rats in the blank group were established.After continuous intervention with Chinese medicine for 7 days，the changes of open field behavior，sleep time，Toll-like receptor 4 （TLR4），myeloid differentiation protein 88 （MyD88） and peripheral serum nuclear factor-kappa B （NF-kappa B），TIR base domain linker molecule for inducing interferon β （TRIF） were compared in each group.Results：Tianwang Buxin Pill could significantly reduce the central lattice residence time and modification times of insomnia model rats，and prolong the sleep time and shorten the sleep latency （P<0.05）.The levels of NF-κ B，TRIF，TNF-α，IL-1 in peripheral blood and TLR4 and MyD88 in dorsal raphe nucleus decreased （P<0.05）.Conclusion：Tianwang Buxin Pill can improve insomnia，and its mechanism may be related to the regulation of immunity through TLR4 pathway.

Keywords Insomnia; Model rats; Tianwang Buxin Pill; Behavior; TLR4 signaling pathway; Key factors; TNF-α; IL-1

中圖分类号：R289.4文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.017

失眠是临床常见的睡眠障碍性疾病，流行病学调查显示我国普通人群中约45.4%存在失眠问题[1]，主要表现在难以入眠、醒后复睡困难或醒后精力体力无法恢复，给人们的工作、生活带来严重的困扰。目前治疗失眠的西药多以苯二氮艹卓类、抗抑郁药为主，虽可在一定程度上改善症状，但反弹、成瘾及戒断等严重不良反应影响了治疗依从性。失眠属于中医学“不寐”的范畴，认为阳盛阴衰，阴阳失交是其主要病机，天王补心丹源自《摄生秘剖》，近年来大量临床资料[2-4]均证实天王补心丹可有效治疗不寐，但其作用机制目前尚无定论。

有文献显示长期失眠机体免疫功能受损，有研究人员通过基础实验证实失眠大鼠TLR4信号通路被过度激活[5]，TLR4表达适量时可调节机体的天然免疫系统，如果过度表达时可激活下游核因子-κB信号通路，最终引起细胞炎症反应，从而干扰机体免疫系统。由此我们设想：天王补心丹有效治疗失眠的作用机制是否通过TLR4信号通路进行介导。基于此进行动物实验，旨在进一步研究天王补心丹治疗失眠的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

70只SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，体质量（250±20）g，所有大鼠均购自苏州市冯氏实验动物设备有限公司[医学动物合格证号：SCXK（苏）2015-0009）]。所有大鼠均接受同批次饲料喂养，实验均在每日上午8：00-11：30时间段进行，保持环境安静、通风，温度（26±1.5）℃，湿度（45±2）%。各组大鼠在体质量、性别等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。

1.1.2 药物

天王补心丹（华润三九（临清）药业有限公司，国药准字Z3772003）成分：生地黄120 g、五味子、当归身、天冬、麦冬、柏子仁、酸枣仁各30 g、人参、玄参、丹参、白茯苓、远志、桔梗各15 g。

1.1.3 试剂与仪器

核因子-κB ELISA试剂盒（江苏江莱生物技术有限公司，批号：27382），TRIF ELISA试剂盒（江苏江莱生物技术有限公司，批号：281723），TLR4一抗抗体（购自美国Abcam公司，货号：ab13556），MyD88一抗抗体（美国Abcam公司，货号：ab2064），β-actin一抗（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0061r），PCPA（购自TargetMol，货号：T1447）。

涡旋振荡仪（上海珂淮仪器有限公司，型号：WS-50D）;转膜系统（购于Bio-Rad公司，型号：Trans-Blot SD）;台式高速离心机（Eppendorf，型号：5418）。

1.2 干预方法

1.2.1 分组与模型制备

分组：70只大鼠随机分为空白组和造模组，空白组15只，造模组60只，将60只造模组进行失眠模型制备，最终45只成模，将成模的大鼠随机分为模型组、低剂量组及高剂量组，每组15只。

模型制备[5]：将所有动物适应性喂养7 d后进行模型制备，每日8：00开始造模，对造模组大鼠腹腔注射PCPA混悬液（0.4 g/kg），连续注射2 d。当动物出现昼夜节律消失，白天夜晚均活动不停时提示失眠模型制备成功。

1.2.2 给药方法

根据人/鼠公斤体质量的等效剂量计算方法，本研究的天王补心丹悬浊液药量为7.5 g/kg，去药渣合并药液后对药汁进行浓缩，利用婆梅氏比重计对浓缩后药汁的浓度进行测量，使最终药液浓度为1.06 g/mL。随后对中药组大鼠进行低（7 g/kg）、高剂量（28 g/kg），空白组及模型组大鼠接受1 mL生理盐水干预。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 行为学

于最后1 d干预结束30 min后将各组大鼠置于自制木箱内，记录大鼠3 min内站立次数、停留中央网格的时间（t）、修饰次数以及排便颗粒。

1.2.3.2 翻正反射试验（睡眠状况）

根据参考文献[5-6]所述，翻正反射消失提示进入睡眠。本实验于最后一日干预结束后每组随机抓取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg），记录大鼠睡眠潜伏期及睡眠时间。

1.2.3.3 用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测法测定各组外周血核因子-κB、TRIF水平变化

于最后1 d干预结束后每组随机抓取3只大鼠，取其腹主动脉血5 mL，高速离心后取出上清液，用相应的ELISA试剂盒对各组细胞的核因子-κB、TRIF、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1）水平进行检测，具体步骤如下：将样本加入ELISA反应孔板中，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，加入PBS洗涤2次，3 min/次，同时设置空白对照孔，再加入的酶标抗体，室温下孵育1 h后加入PBS洗涤2次，3 min/次。反应结束后先后于空中加入0.1 mL的TMB及0.05 mL的2 mol/L硫酸，最后用酶联免疫检测仪测定各孔的吸光值（A值）。操作过程完全按照说明书进行。

1.2.3.4 用Western Bloting测定各组中缝背核TLR4、MyD88水平变化

于最后1 d干预结束后每组随机抓取3只大鼠，充分麻醉后处死，取中缝背核组织200 mg加1 mL裂解缓冲液，4 ℃，15 000 r/min，离心，冰浴中超声，20 s/次，间隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL测蛋白含量。BCA法测蛋白浓度，用凝胶加样缓冲液将各管蛋白浓度调为一致（2 mg/mL），取20 μL样品煮沸5 min。电泳（5%浓缩胶，12%分离胶，60 V，40 mA，2.5 h）结束后将凝胶取出，进行转膜，按照胶在负极，膜在正极的原则，100 V，250 mA，时间依据各指标分子量大小而定，将硝酸纤维素膜取出，用丽春红对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行预染，看电泳带是否清晰，证实蛋白质确实转移到膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗3次，每次5 min，分别加入抗TLR4、MyD88、β-actin一抗抗体孵育，4 ℃过夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记与一抗相抗的二抗IgG（1∶2 000）室温50 min，TBST洗3次，每次5 min。将滤膜放入配好的显色液中反应1 min，计算机扫描图像，并由生物图像分析系统（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美国）分析处理。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件分析处理，所得数据以均数±标准差（±s）表示，4组数据同时符合正态分布和方差齐性则采用单因素方差分析，若其中一组数据不符合正态分布，则采用多组秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组睡眠状况比较

在翻正反射实验中发现造模大鼠睡眠时间短，睡眠潜伏期明显延长，经过天王补心丹干预后大鼠睡眠时间延长，睡眠潜伏期缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组行为学差异

研究发现失眠模型制备大鼠在中央格停留时间、修饰次数以及排便量明显增多，经过天王补心丹干预后大鼠中央格停留时间、修饰次数、排便颗粒明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平比较

经过ELISA检测后发现模型组大鼠外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平明显升高，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05），经过天王补心丹干预后外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 各组中缝背核TLR4、MyD88水平变化

模型组大鼠中缝背TLR4、MyD88表达明显升高，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05），经过天王补心丹干预后中缝背TLR4、MyD88表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

3 讨论

失眠属于中医学“不得眠”“不得寐”“目不瞑”等范畴，早在《黄帝内经》时期即已对此病的病因病机进行探析。正如《灵枢·口问》描述：“阳气尽，阴气盛，则目瞑;阴气尽而阳气盛，则寤矣。”认为睡眠-觉醒周期取决于机体的阴阳消长平衡。至宋代医家认为：“卧则魂归于肝，神静而得寐，今肝有邪，魂不得归，是以卧则魂扬若离体也。”提出肝藏魂功能与睡眠正常与否息息相关。随着对失眠病因病机的进一步认知，清代医家描述：“盖日不能寐者，乃肾不交于心;夜不能寐者，乃心不交于肾也。”“阳气自动而之静，则寐;阴气自静而之动，则寤;不寐者，病在阳不交阴也。”认为心肾不交、阴阳失调是导致失眠的重要原因[7-10]。虽然历代医家对失眠的病因病机认识各有侧重，但归根结底“脏腑失衡，阳不入阴、营卫失和”贯穿于疾病始终。天王补心丹首载于《摄生总要》，历代医家将其广泛应用于失眠的治疗，并取得了理想疗效。该方含有生地黄、五味子、当归身、天冬、麦冬、柏子仁、酸枣仁、人参、玄参、丹参、茯苓、远志、桔梗。方中重用生地黄，联合玄参共为君药，共行使滋阴养血之功，以滋补肝肾之阴血为主，水盛则火得以抑制，血不燥则津自润[11]。天冬、麦冬加强君药滋阴之功，柏子仁、酸枣仁、当归有养血养心安神的作用，诸药共为臣药，助君药滋阴润燥养心。配以人参加强益气的作用，气为血帅，气充则阴血自生，此外，人参亦有养心安神的作用[12]。五味子有益气滋肾，生津敛阴之功，携人参共奏补气生阴之功。茯苓、远志有健脾养血安神益智的作用，又可交通心肾。丹参清热活血养心，使诸药补而不滞[13]。朱砂可清热镇心，安神，兼治其标。桔梗质轻浮，性上行，为使药可能引诸药上行，发挥“舟楫”之用[14]。诸药合用，共奏补益心肾、滋阴养血、调和阴阳的功效，与失眠中医病机一一对应，故可针对性治疗失眠。

本研究利用PCPA腹腔注射制备失眠动物模型，在成模大鼠中，通过旷场实验及翻正反射实验观察到大鼠的确出现了在中央格停留时间、修饰次数以及排便量明显增多，睡眠时间短，睡眠潜伏期明显延长的睡眠障碍征象。在经过天王补心丹干预后大鼠中央格停留时间、修饰次数和粪便颗粒数均明显减少，睡眠指标亦明显改善，这提示天王补心丹明显改善了失眠模型大鼠的行为学及睡眠质量，这一结果与国内外临床研究或动物研究一致[5，15-17]。有研究表明处于失眠状态的机体淋巴细胞的表达及功能均产生变化，有数据显示大鼠在接受睡眠剥夺后NK细胞数目明显减少，在满足大鼠的睡眠需求后NK细胞表达回归至正常水平。也有临床研究显示失眠患者血浆IL-1和核因子-κB水平升高，当患者睡眠时间延长时此类现象被抑制。因此越来越多学者将研究失眠发生机制的视角集中于机体固有免疫应答方面[18-19]。有资料显示失眠模型大鼠TLR4信号通路关键基因表达水平上升，TLR4信号通路是调节机体免疫的重要生物信号[5，20]。本研究亦证实接受失眠模型制备的大鼠外周血及脑组织的TLR4信号通路关键因子出现了过表达现象，且TNF-α、IL-1水平同时升高，认为失眠激活了TLR4信号通路，同时激活了机体的炎症反应，导致TNF-α、IL-1等炎症介质的表达。

因此，本研究证实天王补心丹可改善失眠，其作用机制可能是通过抑制TLR4通路关键因子过表达，抑制了机体的炎症反应，调整机体的免疫功能而实现的。

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（2019-10-12收稿 責任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81273851）

作者简介：刘珊（1988.08—），女，硕士，医师，研究方向：中医内科学，E-mail：sknq80@163.com