针刀松解法治疗髌骨半脱位的相关分子机制实验研究*

宋寒冰，李远峰，刘家兴，王革强，任树军，徐英杰,姜益常

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

髌骨半脱位是临床中比较常见的疾病，随着对本病认识的不断深入，在临床中的诊断率不断升高。髌骨半脱位是指髌骨未完全脱离股骨髁间沟并向外移位，导致膝关节疼痛、无力、弹响和脱臼感等一系列临床症状[1]，属中医的“膝痹病”的范畴。可自愈，但容易复发。若此病迁延不愈或病情较重可加速关节退变、髌骨软化等，目前对髌骨半脱位的临床研究和实验研究仍比较匮乏，治疗上以开放性手术或关节镜治疗为主[2]，然而手术治疗具有费用高、产生创伤、术后长期关节康复锻炼及长时间卧床休养等缺点，且治疗后复发率较高[3]。

针刀疗法为朱汉章教授于1976年发明的创新性中医外科治疗方法，其结合中医针灸理论的“针”和现代医学的“手术刀”为一体，在生理解剖及中医理论的指导下，通过松解人体筋脉、刺激穴位进行治疗[4]。近些年来，针刀疗法被广泛应用于临床治疗内、外科疾病，取得了满意疗效。针刀松解法治疗髌骨半脱位，其操作特点可以在闭合、微创的条件下，直达病变部位进行切割、松解和剥离，从而达到治疗目的[5]。近些年来，通过黑龙江中医药大学附属第一医院骨伤科医疗科研团队的10余年临床观察和研究总结，发现针刀松解法对于习惯性髌骨半脱位的治疗效果确切，且不易复发[6]。通过观察发现，髌骨半脱位可出现关节腔内的韧带及骨关节关系的改变，亦可发生无菌性炎性渗出、关节积液等情况。这可能因髌骨与股骨髁反复撞击、摩擦产生的软骨碎片坏死、变性刺激周围组织而产生，进而破坏关节内滑膜、软骨和韧带等结构，尤其导致关节软骨退变显著，进而更易于发生膝关节骨性关节炎、髌骨软化症和关节变形等继发病变[7]。

通过前期临床观察研究，针刀松解法对髌骨半脱位的疗效可靠，但是其作用机制仍限于力学关系等宏观层面的认识。通过多年的临床病例研究发现，经针刀松解法治疗后，髌骨半脱位患者的关节炎性积液、疼痛、肿胀和关节功能障碍等症状得到明显缓解[8]。所以为了进一步的发现和深入的研究，本研究通过动物实验探讨针刀松解法治疗髌骨半脱位的分子作用机制，以验证和寻求髌骨半脱位的病理变化，为针刀松解法治疗髌骨半脱位提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

所有参与实验动物全部为1月龄的新西兰大兔(动物许可证号：23002000000209；哈尔滨市呼兰区白奎镇天兴养殖场)，共48只大兔随机分为4组，每组12只大兔(6只雌性、6只雄性)，分别为治疗组、阳性对照组、模型组和假手术组。

1.2 动物造模

选择健康大兔制作髌骨半脱位模型，具体的操作方法为：麻醉成功后对大兔两后腿膝关节备皮，消毒后，于膝关节正中切开约2 cm，逐层暴露髌股关节，沿着髌骨内外缘切开关节囊，将髌骨推移向外侧，使其处于半脱位状态，重叠缝合外侧关节囊，屈伸膝关节验证髌骨未能复位，术毕冲洗缝合。假手术组只做皮肤切开缝合，不做任何处理。造模成功后常规饲养，术后1周对大兔进行定期驱赶，每日2次，每次30 min。4周后将所有造模大兔行X线检查髌骨轴位片，进一步验证造模成功[9]。

1.3 主要实验仪器及试剂

低温离心机(山东博科TD-5M型)；超低温保存箱(澳柯玛 DW-86L630)；酶标分析仪(美国宝特ELX808型)；孵育箱(北京福意电器有限公司，FYL-YS-150L型)；HBS-4009自动洗板机(南京德铁实验设备有限公司)；显微镜(北京测维光电厂)。Ⅱ胶原酶试剂盒(美国sigma公司)；高糖培养液(南京迪兆生物科技有限公司)。

1.4 治疗方法

1.4.1 治疗组 采用针刀松解法进行治疗(针刀选择一次性无菌针刀，江西老宗医医疗器械有限公司生产，型号0.35 mm×45 mm)，尽量伸直大兔膝关节，治疗部位常规消毒铺单，0.75%利多卡因注射液做局部麻醉，寻找兔股四头肌外侧头、髌外侧缘紧张位点为进针点快速刺入皮肤，保持刀口线与腱束方向垂直。充分松解痉挛的肌筋膜，手感松动后即出刀。针刀松解后并将髌骨向内侧推挤3～5下，术毕敷料缠扎[10]，每周1次，4周为一疗程。

1.4.2 阳性对照组 采用电针进行治疗(针灸针：华佗牌针灸针,型号0.35 mm×40 mm,苏州医疗用品有限公司；脉冲针灸治疗仪：KWD-808I常州英迪电子医疗器械有限公司)。取穴:主要选鹤顶、犊鼻、阳陵泉及足三里穴位;斜刺进针0.5 cm，采用泻法施针，在施针手感得气之后留针，电针刺激治疗15 min(电流3 mA，刺激频率50 Hz),隔日1次，4周为一疗程。

1.4.3 模型组 常规造模，不作任何处置，同期饲养[11]。

1.4.4 假手术组 非模型大兔，同期饲养。

1.5 观察方法

1.5.1 Lequesne MG评分 利用改良Lequesne MG评分表进行治疗前后局部疼痛刺激反应、步态、关节活动和关节肿胀等行为学分析， 改良Lequesne MG评分量表与关节的活动障碍程度及疼痛程度呈正相关,评分标准见表1[12]。

表1 改良Lequesne MG评分表

1.5.2 髌股指数 髌股指数指内侧髌股关节间隙最短距离与外侧髌股关节最短距离之比可用于观察髌骨半脱位程度，正常髌股指数为≤1∶1.6[13]。将所有实验动物进行X线拍片，分析各组髌股指数的变化。

1.5.3 症性因子检测 将髌骨的软骨细胞进行分离提取，细胞培养后，ELISA试剂盒分别检测细胞中IL-1、TNF-α和MMP- 3等相关炎性因子的治疗前后变化；软骨组织进行免疫组化定性分析。应用到的试剂有高糖培养液、定时定量荧光检测及免疫印迹试验检测[14]。

1.6 统计学方法

应用SPSS 16.0软件对检测数据进行常规统计学分析，所有数据均采用K-S检验对比，治疗评分结果进行T检验。多重检验方法进行组间分析，并利用P值检验是否具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组改良Lequesne MG评分比较

各组结果见表2，治疗前，治疗组阳性对照组、模型组与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，可见模型制作成功。治疗后，阳性对照组及治疗组Lequesne MG评分与模型组比较均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且治疗组评分最低。可见阳性对照组(电针治疗组)缓解了髌骨半脱位症状，而治疗组(针刀松解法)更为有效。

表2 各组改良Lequesne MG评分比较

2.2 各组髌股指数比较

对髌股指数变化分析，可见阳性对照组及治疗组髌骨指数显著高于模型组(P<0.05)，治疗组较阳性对照组髌骨指数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组髌股指数变化

2.3 各组髌骨软骨细胞IL-1、TNF-α及MMP-3含量比较

髌骨半脱位的软骨损伤程度与炎症因子的表达含量变化相关，通过ELISA法对髌骨软骨细胞中IL-1、TFN-α及MMP-3等炎症因子的含量观察，可见治疗组较阳性对照组及模型组IL-1、TFN-α及MMP-3含量均呈显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 各组髌骨软骨细胞中IL- 1、TNF-α、MMP-3的含量

2.4 各组软骨组织MMP-3、TNF-α及IL-1免渡表达比较

本研究中，软骨组织免疫组化定性分析显示MMP-3、TNF-α及IL-1的阳性染色主要定位于细胞质，阳性信号呈现棕黄色。以IL-1的免疫组化染色为例，结果如图1所示，假手术组MMP-3、TNF-α及IL-1染色呈阴性，胞质内无明显棕黄色染色;模型组，MMP-3、TNF-α和IL-1免疫组化染色呈阳性，镜下呈棕黄色异染颗粒;而治疗组和阳性对照组棕黄色异染颗粒明显减少，治疗组黄色异染颗粒最少。各组阳性表达率差异具有统计学意义，其中治疗组降低作用最为显著。见表5。

注:A.假手术组;B.模型组;C.治疗组;D.阳性对照组。图1 炎性因子IL-1免疫组化表达(100×)

表5 IL-1免疫组化分布对比 (%)

3 讨论

目前，在临床上髌骨半脱位尚无确效的保守治疗方法，开放性手术治疗对于膝关节的副损伤较大，且较易复发[15]。近年来，关节镜在临床关节疾病治疗中广泛应用[16]，然而在髌骨半脱位的治疗上仍然得不到较好的效果，复发率较高。康复锻炼和外固定治疗是现阶段临床中治疗髌骨半脱位常见的疗法[17]，通过这些方法治疗，可以暂时缓解症状，但是无法根本性地解决髌骨内、外侧肌力失衡，除去治疗后仍会复发。

髌骨半脱位如果迁延不愈或逐渐加重，则会引起关节加速退变、关节软骨损伤和继发性滑膜炎等进一步功能障碍[18]。其主要症状为突发疼痛、膝关节伸膝无力和髌骨弹响,甚至偶发脱臼感。

针刀疗法目前在临床中应用十分广泛，在中医理论基础、现代解剖理论及生物力学的指导下，通过临床实践不断总结和探索，针刀治疗方法不断改善，其治疗适应症亦不断的拓展[19]。其主要特点是既体现了中医治疗的“简、便、廉、验”，又可有现代医学微创、快速康复的理念,其治疗过程简便、安全、微创、不用缝合、低感染风险、不易引起不良反应、患者易于接受、治疗时间短、术后能够快速恢复及不影响正常工作和学习，治疗优势突显[20]。

膝关节是人体中最大的负重关节，其结构的失稳、力学的平衡破坏是膝关节病变的主要原因之一。运用针刀松解法治疗髌骨半脱位，主要于髌外侧支持带、股四头肌外侧头处进行充分松解，剥离黏连组织，平衡髌周肌力，松解紧张痉挛的肌肉及韧带，恢复髌骨的生理解剖结构及髌骨周围的力学平衡[21]。治疗后减轻髌骨对股骨外髁撞击而产生的髌软骨面损伤，预防关节磨损退变而导致的膝关节韧带、滑膜等组织的紊乱,减轻无菌性炎症、促进血液循环和改善关节内代谢，使膝关节恢复动态平衡[22]。

髌骨半脱位发病机制与平衡关节内、外不均衡的应力对髌骨及股骨髁软骨产生压力及不良摩擦相关，从而影响了软骨细胞的代谢，通过软骨细胞的力学信号的转导，从而影响软骨细胞代谢及基因表达，所产生的炎性因子进一步刺激关节软骨及周围组织，产生疼痛及退变增生导致关节内系统性恶性循环[23]。 TNF-α和IL-1与软骨损伤破坏密切相关。当髌骨半脱位处于发生、发展过程中，髌骨软骨遭到破坏，往往上述TNF-α和IL-1含量升高。已经被证实上述两种因子的高水平表达可以抑制软骨细胞生长和软骨细胞的再生，亦可产生软骨相关蛋白变性，减少了软骨细胞的合成。其亦可以抑制软骨细胞MMPs 酶的水平升高，破坏MMPs 酶的活性，进一步促进软骨细胞释放炎性介质(如一氧化氮、地诺前列酮等)，最终导致髌骨软骨加速损伤[24]。通过针刀松解法治疗，减轻髌骨软骨所承受的机械压力及摩擦力，促进软骨自我修复机制，有效阻断IL-l 和TNF-α炎性因子的合成，减少对MMPs酶合成的抑制作用，纠正软骨细胞内的无菌性炎症因子水平，促进软骨蛋白生成，促进软骨修复与再生[25]。

本研究采用针刀松解法对大鼠髌骨半脱位模型进行实验研究，并对小针刀疗法可能的作用机制进行探讨，验证了针刀松解疗法不仅能够促进髌骨的生理解剖结构的恢复，亦能够调节IL-1、TNF-α以及MMPs-3的异常表达，从而对髌骨半脱位产生治疗作用，初步解释了针刀松解法治疗髌骨半脱位的分子作用机制，并为临床的治疗和推广提供了可靠的实验证据。