葡萄酒渣多酚-壳聚糖-CMC可食性复合膜在水煮羊肉贮藏中的应用

田玉潭，马 露，刘 军，，李冬冬，，陶迎梅，，赵晓璐，马亚男，孙少忆，刘敦华，，*

(宁夏大学 a. 食品与葡萄酒学院；b. 农学院，宁夏 银川 750021)

水煮羊肉不仅营养丰富，而且风味优良，受到广大消费者的喜爱，但在贮藏过程中容易因微生物作用而发生腐败变质，危害人类健康。包装材料对于保持羊肉风味、延长货架期具有至关重要的作用[1]。当前使用的包装材料多采用塑料包装。塑料是由不可再生资源合成的，大量使用会严重污染环境[2]。与传统的塑料包装相比，可食性复合膜将食品、防腐、包装的概念揉合在一起，制得可食用、可生物降解、防止食物变色、防止产生异味、延长货架期并赋予食品安全性的膜。可食性复合膜多以壳聚糖等多糖类物质为膜基进行制备，但多糖薄膜亲水性强，阻隔性能差。将活性物质添加到壳聚糖中[3]，可以改善薄膜的性能，起到良好的贮藏效果。王正荣等[4]以猪肉饼为材料，研究了不同质量浓度的迷迭香与壳聚糖复合涂膜对猪肉饼的保鲜效果和抗氧化性，发现质量浓度为1.0、1.5 g·L-1迷迭香和壳聚糖复合膜能使冷藏肉饼的货架期延长至15 d左右。于林等[5]研究了茶多酚改性后的胶原蛋白-壳聚糖复合膜对冷藏斜带石斑鱼的保鲜效果，发现在4 ℃冷藏条件下，茶多酚改性胶原蛋白-壳聚糖复合膜处理组能有效延缓斜带石斑鱼的腐败变质。祝美云等[6]以壳聚糖、甲基纤维素和单甘酯为复合涂膜材料，研究了不同浓度涂膜的黄瓜贮藏过程中的生理变化，得到复合膜的最优涂膜浓度为壳聚糖2.0%、单甘酯0.2%、MC 0.2%。

葡萄酒在酿造过程中只能提取出30%～40%的酚类化合物[7]，酿酒后剩余的葡萄酒渣中仍含有较多的葡萄多酚类物质[8]，被当做废弃物处理，既污染环境又造成资源的浪费[9]。研究表明，葡萄酒渣多酚具有较强的抗氧化、抑菌活性[5]，将葡萄酒渣多酚添加到壳聚糖中，也许可以制得具有安全、环保、抗氧化、抑菌性能的可食性复合膜，以延长食品的货架期。本文将葡萄酒渣多酚添加到壳聚糖和CMC的混合液中制备葡萄酒渣多酚-壳聚糖-CMC复合膜。利用不同浓度(1%、3%、5%)的葡萄酒渣多酚-壳聚糖-CMC复合膜、迷迭香复合膜、茶多酚复合膜和保鲜膜对水煮羊肉进行处理并冷藏[(4±1) ℃]，比较不同膜处理水煮羊肉的理化指标变化，对比不同膜处理对于水煮羊肉贮藏效果的影响，以期达到延长水煮羊肉货架期的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊肉购于宁夏星海牧场；葡萄酒渣由宁夏大学农学院提供，自然风干。

壳聚糖(脱乙酰度≥95%，食品级)，河南祥瑞食品添加有限公司；羧甲基纤维素钠(食品级)，上海申光；甘油(食品级)，北京生物科学技术有限公司；茶多酚，广州馨之味食品配料商城；迷迭香，广州馨之味食品配料商城；平板计数琼脂培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

K9860型自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司；Agilent 5975GC-MSD型气质联用仪质谱仪，安捷伦科技有限公司；DB-5MS型毛细管柱，北京德隆伟业科技有限公司；DP-400型色差仪，北京亚欧德鹏科技有限公司；pHS-2F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HHS-21-6电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DF-Ⅱ数显集热式磁力搅拌器，金坛市华城全禾实验仪器厂；LRH-150-B生化培养箱，上海合恒仪器设备有限公司；T6新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-500DE型数控超声，昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒渣多酚的提取

在前期对葡萄酒渣多酚提取工艺进行优化的基础上，将葡萄酒渣破碎，称取10 g置于锥形瓶中，添加体积分数为47%的乙醇溶液，料液比为1∶10，用超声波超声108 min，超声处理的功率为250 W，超声处理的温度为70 ℃；真空抽滤后浓缩至10 mL，备用。

1.3.2 葡萄酒渣多酚-壳聚糖复合膜的制备

将2 g壳聚糖溶于80 mL 1%醋酸溶液中，55 ℃水浴加热并搅拌30 min。将4 g羧甲基纤维素钠用120 mL蒸馏水溶解。将20 g壳聚糖溶液和20 g羧甲基纤维素钠溶液混合，分别取0.5、1.5、2.5 g葡萄酒渣多酚加入混合溶液中，添加2 g甘油，混合均匀后倒置在半径为4.8 cm、面积为72.38 cm2的圆形玻璃培养皿中，静置24 h，置于45 ℃烘箱10 h干燥成膜，分别制成1%、3%、5%的葡萄酒渣多酚-壳聚糖复合膜。

1.3.3 迷迭香(3%)复合膜、茶多酚(3%)复合膜的制备

按照1.3.2节的工艺进行制备，将葡萄酒渣多酚分别换成迷迭香(1.5 g)、茶多酚(1.5 g)。

1.3.4 可食性复合膜处理水煮羊肉

将羊肉背最长肌均匀切割为长3 cm、宽2 cm、高1.5 cm，约10 g的肉块，剔去脂肪，浸泡清洗。煮制，不添加辅料，煮制的过程中捞出血沫，中心温度达到70～75 ℃后，取出羊肉冷却；用制备好的迷迭香复合膜、茶多酚复合膜和不同浓度的葡萄酒渣多酚-壳聚糖复合膜将羊肉进行包裹，4 ℃冰箱贮藏，每隔3 d取出样品进行指标测定。

1.3.5 感官评价

由具有食品专业背景、个人身体状况良好的5名男同学和5名女同学组成感官评定小组，对羊肉进行感官评价，满分为100分。在感官评定前注意饮食清淡，不喝酒不抽烟。感官评分标准见表1。

1.3.6 指标测定

pH：将1.0 g羊肉加到10 mL去离子水中，均质10 min，用pH计测量。

色度：参照王倩等[10]的方法，选取3个切割面使用自动色差仪测量羊肉的表面颜色。记录L*(亮度)、a*(红色)和b*(黄色)的值以确定贮藏过程中肉的颜色变化。

TBA值：参考孔维洲[11]的方法，略作修改。称量贮藏期的羊肉5 g，粉碎后添加25 mL 7.5%的三氯乙酸(0.1% EDTA)溶液，用磁力搅拌器搅拌30 min，过滤并取上层清液5 mL，添加5 mL 0.02 mol·L-1的硫代巴比妥酸；90 ℃水浴40 min，冷却后离心；在溶液中添加5 mL的氯仿，充分混匀后静置，取上清液；在532 nm和560 nm处测定其吸光度，计算TBA值。

TVB-N：参照邵金良等[12]方法，称取除去脂肪的羊肉背最长肌混合均匀样品10.0 g，置于锥形瓶中，加入蒸馏水，料液比为1∶10，保持振荡，浸渍30 min后过滤，滤液置冰箱备用。仪器条件：硼酸吸收液10.0 mL(不加蒸馏水和碱)，蒸馏时间为5.0 min。测定：吸取5.0 mL样品滤液于体积为300.0 mL消化管中，加入5 mL碳酸钾溶液，进行蒸馏、滴定。同时做空白试验(用蒸馏水代替样液)。

表1 水煮羊肉的感官评分标准

菌落总数参考GB 4789.2—2016《食品微生物菌落总数的测定》进行测定，采用系列稀释和平板计数法进行计数。

挥发性物质的测定参照丁晔等[13]的方法。样品预处理：将样品粉碎成糜状备用。固相微萃取(SPME)：在20 mL顶空瓶中加入5 g样品，加入20%氯化钠，混匀，将顶空瓶放90 ℃水浴锅中恒温加热1 h，用老化好的SPME针头插入样品瓶中萃取40 min。进样，使待测组分解析和分析。气相色谱(GC)条件：毛细管柱采用DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.5 μm;Agilent Technologies) 柱，以He为载气，恒定流速为3.7 mL·min-1，未分流；进样口温度为250 ℃，FID检测器温度为250 ℃，柱箱采用程序升温，初始温度50 ℃，保持2 min，以15 ℃·min-1升温到100 ℃，然后以5 ℃·min-1升温到220 ℃，保持10 min，再以10 ℃·min-1升温到260 ℃，最后以5 ℃·min-1升温到280 ℃，结束。质谱(MS)条件：色谱、质谱的接口温度为250 ℃，谱库NIST05a.L。质谱质量扫描范围20～450 amu。采用峰面积归一化法计算各挥发性物质的相对含量。

1.3.7 数据处理

采用Excel 2016和Origion 2018对数据进行整理并绘图，采用SPSS 21.0对数据进行显著性分析(P<0.05为差异显著)。

2 结果与分析

2.1 羊肉的感官评价

不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间的颜色、气味、总体可接受程度如表2所示。随着贮藏时间的延长，不同复合膜处理的羊肉(以下简称复合膜处理组)颜色、气味、总体可接受程度均逐渐降低。第9天时，5%多酚膜处理组的颜色评分为26.34，气味评分为27.46，总体可接受度为15.37，显著高于其他复合膜处理组(P<0.05)。说明贮藏至第9天，与其他复合膜相比，5%多酚膜能更有效地保持羊肉的颜色、气味和总体可接受性。

表2 不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间颜色、气味、总体可接受度的变化

2.2 羊肉pH的变化

pH变化可反映食品生产过程中的微生物生长与酶促反应程度[14]。不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间pH变化如图1所示。羊肉的起始pH为5.36，除5%多酚膜处理组外，其他复合膜处理组pH变化均呈现先升高后降低再升高的变化趋势，第0～3天，所有处理pH均呈上升趋势，这可能与滩羊肉贮藏期间蛋白质在微生物作用下的降解程度增加导致的碱性基团释放有关[15]；而第9天至第12天所有处理pH的增加可能是因为贮藏后期滩羊肉质的腐败程度增加。贮藏末期时(第12天)可观察到，5%多酚膜处理组pH显著(P<0.05)低于其他复合膜处理组。值得注意的是，保鲜膜、迷迭香与茶多酚复合膜处理组在贮藏第3～6天时pH出现降低，这与张慧芸等[16]发现的丁香精油-壳聚糖复合可食性膜对生肉糜保鲜效果的研究结果一致，肉品冷藏期间pH降低可能与细菌分解肉中葡萄糖产酸有关。

无相同小写字母表示贮藏相同时间不同处理之间差异显著(P<0.05)，无相同大写字母表示同一处理不同贮藏时间差异显著(P<0.05)。下同。Without the same lowercase letters indicated significant difference among different treatments at the same storage time (P<0.05)，Without the same capital letters indicated significant difference in the same treatment at different storage time (P<0.05). The same as below.图1 不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间的pH变化Fig.1 Changes of pH value of mutton treated with different films during storage at 4 ℃

2.3 羊肉色度的变化

色泽是新鲜肉类的重要视觉质量指标[17]。不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间的色度变化如表3所示。随着贮藏时间的延长，羊肉表面失去光泽，红色褪去，黄度增加。贮藏至第9天时，保鲜膜处理组肉样完全腐败变质，其a*在6组膜处理中最低(6.22)，b*最高(15.99)。贮藏末期保鲜膜处理组L*大于其他各组，说明羊肉亮度大，表面有光泽。不同浓度的多酚膜处理组a*、b*、L*较保鲜膜、茶多酚膜、迷迭香膜处理组总体变化缓慢。因此，不同浓度的多酚膜处理组可有效延缓羊肉贮藏期间的氧化过程，改善羊肉的外观色泽，延长贮藏时间。

表3 不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间的色度变化

2.4 羊肉TBA值的变化

TBA值可反应羊肉的脂质氧化，TBA值越高表明脂质氧化程度越高[18]。不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏的TBA值变化如图2所示。第0天时，羊肉的TBA值为8.2 mg·kg-1；第0至9天，保鲜膜、茶多酚膜处理组TBA值迅速上升，不同浓度的多酚膜和迷迭香膜处理组TBA值在整个贮藏期变化缓慢；贮藏至第12天时，保鲜膜、茶多酚膜、迷迭香膜处理组TBA值分别达到38.1、46.3、29.9 mg·kg-1，而1%多酚膜、3%多酚膜、5%多酚膜处理组TBA值分别为26.3、27.9、27.6 mg·kg-1，显著(P<0.05)低于保鲜膜、茶多酚膜、迷迭香膜处理组，说明多酚膜能够有效延缓羊肉在贮藏过程中的脂质氧化速率。

图2 不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间TBA值的变化Fig.2 Changes of TBA value of mutton treated with different films during storage at 4 ℃

2.5 羊肉TVB-N的变化

TVB-N是羊肉变质的指标，可能主要归因于细菌对含氮化合物分解代谢产生的氨[19]。不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏的TVB-N变化如图3所示。羊肉TVB-N的限值为150 mg·kg-1[20]。在贮藏第9天时，保鲜膜、茶多酚膜、迷迭香膜、1%、3%多酚膜处理组的TVB-N分别为239.2、271.4、213.2、213.6、174.7 mg·kg-1，均超过限值，肉样已腐败变质；5%多酚膜处理组TVB-N为138.3 mg·kg-1，仍低于限值，且显著(P<0.05)低于其他复合膜处理组。在贮藏第12天时，5%多酚膜处理组TVB-N达到213.7 mg·kg-1，肉样腐烂，说明羊肉的贮藏时间不能超过9 d；此外，多酚浓度越大，羊肉的TVB-N越低。

图3 不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间TVB-N的变化Fig.3 Changes of TVB-N of mutton treated with different films during storage at 4 ℃

2.6 羊肉菌落总数的变化

在羊肉贮藏过程中，腐败微生物的生长会影响羊肉的品质，缩短肉的货架期[21]。不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏的菌落总数变化如图4所示。

图4 不同膜处理羊肉在4 ℃贮藏期间菌落总数的变化Fig.4 Changes of total bacterial count of mutton treated with different films during storage at 4 ℃

在贮藏第0天时，羊肉的菌落总数为3.83 lg CFU·g-1，随着贮藏时间的延长，所有复合膜处理组的菌落总数均呈现逐渐上升的趋势。在贮藏期间，保鲜膜、茶多酚膜、迷迭香膜处理组的菌落总数始终高于不同浓度的多酚膜处理组，在贮藏第9天时，1%、3%、5%多酚膜处理组的菌落总数为5.02、4.73、4.11 lg CFU·g-1，多酚膜处理组之间差异显著(P<0.05)，说明多酚浓度越大，抑菌效果越好。

2.7 挥发性物质的变化

水煮羊肉在4 ℃贮藏期间的挥发性物质相对含量如表4所示。在第0天共检测出醛类8种，酮类5种，烷烃类8种，醇类3种，烯烃类1种，杂环类6种，第0天挥发性物质醛类、酮类、烷烃类、醇类、烯烃类、杂环类相对含量分别为46.49%、5.18%、9.15%、8.14%、0.84%、21.16%。第3天检测出醛类9种，酮类4种，烷烃类10种，醇类6种，烯烃类2种，杂环类10种，第3天挥发性物质醛类、酮类、烷烃类、醇类、烯烃类、杂环类相对含量分别为43.88%、3.32%、4.31%、10.56%、0.72%、23.47%。第6天检测出醛类11种，酮类4种，烷烃类14种，醇类3种，烯烃类2种，杂环类12种，第6天挥发性物质醛类、酮类、烷烃类、醇类、烯烃类、杂环类相对含量分别为46.50%、3.28%、13.53%、9.55%、2.16%、30.64%。第9天检测出醛类11种，酮类3种，烷烃类9种，醇类7种，烯烃类3种，杂环类11种，第9天挥发性物质醛类、酮类、烷烃类、醇类、烯烃类、杂环类相对含量分别为50.91%、3.28%、7.95%、10.18%、4.22%、31.03%；第12天检测出醛类12种，酮类3种，烷烃类7种，醇类4种，烯烃类1种，杂环类5种，其他类6种，第12天挥发性物质醛类、酮类、烷烃类、醇类、烯烃类、杂环类相对含量分别为52.85%、3.10%、9.45%、11.14%、0.75%、16.99%。不同贮藏时间之间的烷烃类和杂环化合物相对含量差异性显著(P<0.05)。醛类可能是多不饱和脂肪酸氧化或降解所产生的[22]，其相对含量呈现出先降低后升高的趋势，表明羊肉在冷藏过程中发生了脂肪氧化或降解[23]。酮类物质可能是由美拉德反应生成，也可能是由脂类降解、氧化或其进一步反应生成[24]，其相对含量先下降后保持稳定，在冷藏过程中可能发生部分散失。烃类物质主要是通过脂肪酸烷氧自由基的均裂生成[24]，烷烃类物质相对含量呈现先下降再升高再下降的趋势。烯烃类物质相对含量先增加后下降。醇类物质主要是由脂肪氧化酶作用于不饱和脂肪酸产生[25]，其相对含量先升高后降低再升高。杂环化合物可能是氨基酸和还原糖之间的美拉德反应、氨基酸的热解和硫胺素的热解等反应生成的[26]，其相对含量呈现先升高后降低的趋势。

表4 羊肉在4 ℃贮藏期间挥发性物质的相对含量

3 结论与讨论

本研究结果表明，葡萄酒渣多酚-壳聚糖-CMC复合膜可以有效改善羊肉的外观色泽，延缓脂质氧化，将羊肉货架期延长至9 d，5%葡萄酒渣多酚-壳聚糖-CMC复合膜可以更有效地保持羊肉的颜色、气味和总体可接受性，抑制微生物的生长，减少腐败变质。

贮藏至第9天时，5%多酚膜处理组的颜色、气味和总体可接受性显著优于其他复合膜处理组，可能是由于其添加了较多的多酚成分，具有很强的抗氧化性，能有效抑制肌红蛋白的氧化，阻止氧代肌红蛋白和肌红蛋白的增加[27]。史建如[28]研究了壳聚糖基褐藻多酚可食膜对冷藏大菱鲆鱼片感官特性的影响，发现壳聚糖基褐藻多酚可食膜处理的鱼片感官特性优于对照组，本实验研究结果与此相一致。5%多酚膜处理组TVB-N为138.3 mg·kg-1，低于限值，多酚浓度越大，抑菌效果越好。多酚添加到壳聚糖中增强了膜的抗菌活性，可能是由于其减少了负电荷并引起细胞破裂或孔形成，从而导致微生物的死亡。Fang等[29]研究了没食子酸/壳聚糖可食用涂层对气调包装中猪肉品质的影响，发现随着没食子酸的掺入，壳聚糖涂层的抗菌活性增强，本实验的研究结果与此相符合。贮藏末期(12 d)，5%多酚膜处理组pH显著低于其他复合膜处理组，pH低于6.5时存在的氨基会导致细胞膜产生去极化效应，并通过分子键合破坏细胞壁完整性，从而导致微生物死亡，延长羊肉的货架期。Farajzadeh等[30]研究发现，壳聚糖-明胶涂层的虾冷藏14 d时pH低于对照组，本研究结果与此相吻合。综合各项指标的测定结果可以看出，多酚膜处理羊肉的贮藏时间可延长至9 d，5%多酚膜处理效果最佳。

葡萄酒渣多酚-壳聚糖-CMC复合膜成膜效果理想，制作过程简单，方法可行，还可食用，具有良好的抗氧化、抗菌活性，能够有效延长食品的货架期，为今后工业化的生产奠定了良好的基础。对于该膜的机械性能，今后还可做进一步研究。

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