热粘结复合纤维人造血管支架的制备及其性能

郭凤云， 过子怡， 高 蕾， 郑霖婧

(1. 浙江理工大学 纺织科学与工程学院， 浙江 杭州 310018；2. 浙江理工大学 先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室， 浙江 杭州 310018)

进入21世纪后，人类心血管疾病的发病率逐年增加，治疗疾病的成本越来越高，这使得临床人造血管支架的需求越来越大。现阶段，内径在6 mm以上的大口径人造血管已经用于临床，但内径小于6 mm的小口径人造血管常会植入失败，因此，新型小口径人造血管的研制和开发具有重要意义。自体或异体移植是临床上进行小口径血管重建的常用方法。但这些方法不可避免地会出现一些问题，如血液相容性差，力学强度较弱等[1]。目前，组织工程制备人造血管支架的方法主要有自组装[2]、水凝胶[3]、溶剂浇铸及浸出、热致相分离、静电纺丝等[4-5]。其中，由于静电纺丝方法参数可控、经济高效，作为具有代表性的制备纤维方法[6]，能够灵活有效地调控材料的组成、尺寸、结构和性能，所以近年来针对静电纺丝人造血管支架的研究日益增加[7-9]。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)等生物可降解高分子，常被用作静电纺制备人造血管支架材料[10-11]，但由于各种各样的缺陷以及组分单一的弱点，限制了其进一步应用。其中，力学性能作为血管支架使用最基本的先决条件，其研究对实际应用显得尤为重要[12-13]。对人造血管支架的力学研究大都基于单向拉伸且强度较弱，没有考虑到其在实际应用中的纵向拉伸及横向伸缩扩张所需的力学差异性。除此之外，具有细胞无毒性、植入后耐穿刺不发生泄露、具备足够的机械循环稳定性等也是人造血管支架所要满足的功能需求。

由于血液相容性差，纤维力学强度较弱等，开发小口径、力学性能持久且功能完整的人造血管支架具有一定的挑战。从纺织材料学角度出发，使用生物相容性的合成材料通过纺织机械加工手段研制力学性能良好，尽可能满足更多功能要求的人造血管支架，成为解决小口径人造血管支架的一个有效方法。在此背景下，本文在前期调控静电纺丝条件、血管材料的组成配比及纤维孔径的工作基础上[14-16]，利用静电纺丝技术结合浸泡脱管法，通过热处理在保证适当孔隙率的情况下制备具有粘结结构的PCL/PU复合纤维小口径人造血管支架，并对人造血管支架的微观结构、双向拉伸强度、细胞毒性和穿刺性等进行分析。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：聚氨酯(颗粒状，相对分子质量为270 000)、聚己内酯(相对分子质量为 80 000)、膨体聚四氟乙烯管(e-PTFE)、羟乙基淀粉HES的生理盐水溶液，国药集团化学试剂有限公司；四氢呋喃(THF)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)，分析纯，北京化工厂；含各种氨基酸和葡萄糖的培养基DMEM、小鼠成纤维细胞，中国科学院细胞库。

仪器：静电纺丝装置(自制)；AGS-X型万能力学测试仪(日本岛津公司)；Quanta 250 FEG型扫描电子显微镜(美国赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；ELx800型酶联免疫监测仪(美国宝特公司)；BZF-50型真空烘箱(上海博讯公司)。

1.2 纤维膜和人造血管支架的制备

首先配制前驱体溶液：将聚氨酯(PU)和聚己内酯(PCL)溶于质量比为1∶1的四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，配制成质量分数为10%的PCL/PU混合溶液，其中PCL与PU质量比为1∶3。此外，将PVP溶于乙醇中，配制成质量分数为8%的PVP溶液，然后进行静电纺丝，具体过程如图1所示。

图1 人造血管支架制备示意图Fig.1 Preparation schematic of artificial blood vessel.(a) Electrospinning process; (b) Tubing-off process

将上述前驱体溶液装入5 mL注射器中，调整合适的流速，设置电压范围为10～20 kV，静电纺丝距离为20 cm。作为对比，PU、PCL/PU和PCL纤维膜静电纺丝过程中直接用铝箔接收。PCL/PU人造血管支架接收装置为直径2、3、5 mm的不锈钢空心转辊。PCL/PU人造血管支架纺丝过程主要包括静电纺丝、溶解脱管和加热粘结，具体为：第1步，纺制1层PVP纤维膜于转辊上；第2步，在PVP纤维膜转辊上继续进行PCL/PU复合纤维的纺丝；第3步，将收集到的纤维和转辊一起置于水中20 h，溶去内层PVP，脱去不锈钢管转辊，将得到的纤维管置入55 ℃干燥箱中热处理，烘干，即可得到PCL/PU人造血管支架材料。

1.3 纤维膜和人造血管支架表面结构表征

将纤维膜剪裁成三角形，贴在样品台表面；将人造血管支架剪开，裁成方形片状，内外表面和横截面分别贴在样品台表面和侧面。喷金处理后用扫描电子显微镜在真空环境观察材料表面和截面形貌结构。

1.4 人造血管支架力学性能测试

选取直径为5 mm的人造血管支架，剪切成小圆柱状，长为15 mm，把样品置于剪好的纸片框架上，空隙间距为5 mm，采用万能力学测试仪进行力学拉伸测试。横向拉伸方向为人造血管支架的圆周方向，纵向拉伸方向为人造血管支架的轴向方向。测试温度为常温，速度为10 mm/min。每个样品至少测试5次，取平均值。根据测得的载荷位移绘制应力与应变曲线，计算样品的断裂强度和断裂伸长率等力学参数。

拉伸力学稳定性测试通过固定拉伸强度为25 MPa和拉伸应变为200%，在仪器循环模式下进行实验。

1.5 人造血管支架耐穿刺性能测试

作为对照，将人造血管支架和商用e-PTFE管分别连在2个封闭的注射器中间，管内填充人造血浆羟乙基淀粉HES的生理盐水溶液，然后用同样大小的注射器针头进行穿刺实验，观察血浆渗出情况。

1.6 人造血管支架细胞毒性测试

首先对人造血管支架进行灭菌处理，然后置于96孔培养板中，添加细胞培养液和小鼠成纤细胞L929，每个孔内加入100 μL细胞悬液，分别培养1、3、5、7 d，加入DMSO、FBS和DMEM等营养基，在设定的时间内进行MTT实验，用酶联免疫检测仪测定波长在490 nm处的吸光度A。每个样品在每个时间点准备5个平行样，取平均值。根据不同时间的空白组和实验组吸光度差值之比，计算细胞的相对活性。

2 结果与讨论

2.1 形貌结构分析

利用图1所示装置制备了不同口径和长度的PCL/PU人造血管支架。PCL/PU人造血管支架呈现明显的中空管状结构，且结构完整可自支撑。通过悬挂重物承重测试发现，人造血管支架可承受416 g的重物。图2示出PCL、PU、PCL/PU纤维膜和PCL/PU人造血管支架的扫描电镜照片。

图2 纤维膜和人造血管的扫描电镜照片Fig.2 SEM images of fibrous film and artificial blood vessel. (a) PU fibrous film(×10 000); (b) PCL/PU fibrous film(×10 000); (c) PCL fibrous film(×10 000); (d) Inner layer of artificial blood vessel(×4 000); (e) Outer layer of artificial blood vessel(×4 000); (f) Cross-sectional of artificial blood vessel(×10 000)

由图2(a)～(c)可以看出，静电纺丝纤维表面光滑，结构完好，有明显的粘结点，纤维呈无序均匀分布状态。经统计纤维直径平均为792 nm。由人造血管支架电镜照片可以看出，其内外表面的纤维光滑无序，分布均匀，含有粘结点结构，截面纤维紧密交错堆叠，该结构对人造血管支架力学性能的增强具有较大的促进作用。本文制备的人造血管支架具有由连续纤维交错堆积形成的三维立体孔结构，具有一定的孔隙。根据质量、密度和体积，通过计算得出人造血管支架的孔隙率约为72%，这有利于细胞渗透、营养物质及代谢产物的输送。

2.2 力学性能分析

为进一步了解材料的力学性能以满足人造血管支架的应用要求，对PCL、PU、PCL/PU纤维膜和PCL/PU人造血管支架进行了拉伸测试，结果如图3所示。研究发现，PCL/PU人造血管支架轴向拉伸强度高达68.6 MPa，较纯PU纤维膜提高约7倍，且在25 MPa拉伸强度和200%的拉伸应变下，循环拉伸15次后材料力学性能仍然能够保持，呈现出良好的拉伸循环稳定性。相比之下，PCL/PU人造血管支架的横向拉伸性能较弱，平均强度为39.3 MPa。分析认为在纵向拉伸过程中，纤维之间形成了三维网络结构，纤维间互相交错相连；而在横向拉伸时，纤维边缘的缺口使得纤维间的滑移比较严重，所以纵向较横向好。但二者均能满足血管支架的力学要求，且这种各向异性的力学性能使其在临床试验中能得到很好的应用，更有利于人造血管支架的伸缩扩张。

图3 纤维膜和人造血管支架的力学性能Fig.3 Mechanical properties of fibrous film(a) and artificial blood vessel(b)

2.3 耐穿刺性能分析

血液透析或者抽血等过程往往需要对血管进行破坏性穿刺，因此，研究人造血管支架的耐穿刺性能具有重要意义。图4示出本文制备的PCL/PU人造血管支架和商用e-PTFE人造血管支架的穿刺实验对比图。研究发现：PCL/PU在穿刺后10 h内液体不会流出，即不会渗血；而e-PTFE管则出现液体泄漏的现象，如图中虚线标记区域所示。表明PCL/PU人造血管支架耐穿刺性较好，液体不会渗出。

图4 人造血管支架穿刺实验Fig.4 Vascular puncture experiment. (a) PCL/PU fibrous artificial blood vessel; (b) Commercial e-PTFE

2.4 细胞毒性分析

在实际的组织工程应用中，所用材料最基本的要求是要保证在一定范围内具有血液相容性和细胞相容性。细胞相容性可由细胞生长状况、形态变化和细胞活性来判断。本文以小鼠成纤细胞L929为例，对人造血管支架材料进行了细胞毒性分析，并与e-PTFE和空白对照试验进行对比，结果如图5所示。

图5 MTT法测试人造血管支架细胞毒性Fig.5 Cell viability according to a MTT assay

结果显示随着时间的增加，细胞相对活性最高达94%，且PCL/PU人造血管支架在第7天的细胞活性优于空白对照和e-PTFE支架，说明本文制备的PCL/PU人造血管支架基本无细胞毒性。

3 结 论

本文利用静电纺丝技术结合浸泡脱管法制备了具有2、3、5 mm内径的聚己内酯/聚氨酯(PCL/PU)人造血管支架。该复合人造血管支架的孔隙率为72%，其力学性能较纯PU纤维膜提升7倍，且横向和纵向均具有优异的拉伸力学性能；培养7 d后其细胞活性为94%，与商用的e-PTFE支架对比，该人造血管支架具有较好的耐穿刺性。本文制备的PCL/PU人造血管支架能满足血管支架的基本要求，在人造血管组织工程领域具有潜在的应用前景。