低温胁迫对玉米苗期叶片生理特性的影响

杨威，冯艳飞，任国鑫，高树仁

（黑龙江八一农垦大学农学院/黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室，大庆163319）

玉米（Zea mays L.）是世界上重要的粮食作物，北方春玉米区是我国玉米主产区之一，占我国玉米播种面积的30%左右。而在这些地区春季低温冷害经常发生，严重限制玉米种子萌发和幼苗的生长发育，甚至可能会导致玉米生长后期籽粒品质及产量下降[1-3]。因此，筛选并鉴定耐低温玉米种质资源，为培育耐低温玉米品种就显得尤为重要。

研究发现，低温会影响玉米等植物细胞的酶活性、膜系统以及各项生理生化指标[4]。游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等细胞渗透调节物质通过调节细胞质渗透压大小来降低低温胁迫对细胞酶蛋白质和生物膜的伤害[3-5]。杨德光等[5]通过低温胁迫对玉米发芽及幼苗各项生理特性的研究发现，低温胁迫下玉米幼苗的MDA含量、POD活性、SOD活性变化趋势均为先升后降，低温胁迫初期上升较快，恢复初期下降较快，即使恢复生长后，各指标均高于常温处理。于海瑞等[6]利用单一变量法分析玉米幼苗低温胁迫后生长发育和生理变化发现，MDA含量和SOD活性均在低温胁迫12 h后达到峰值，POD活性36 h达到峰值。彭云玲等[7]对44份玉米自交系进行低温胁迫性状鉴定，使用隶属函数法进行耐寒性综合评价，结果表明低温处理后，POD和SOD活性有相似的变化趋势，而且随着低温时间加长，下降幅度逐渐增大，由于材料不同，少则下降5.29%，多则下降74.95%。根据前人研究发现，通过分析不同品种的保护酶活性和丙二醛含量下降或上升幅度大小可以为筛选耐寒种质提供理论参考。

因此，试验以前期萌芽期低温胁迫实验获得的4份玉米种质资源为研究对象，三叶一心期进行低温胁迫，通过观察植株表型和测定叶片生理生化指标来进一步鉴定其对低温胁迫的响应，为玉米耐低温种质资源评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

4份玉米自交系，其中C71、东91和京33为萌芽期低温不敏感型，东46为萌芽期低温敏感型，由黑龙江八一农垦大学玉米育种研究室提供。

1.2 试验设计

选择玉米种粒均匀饱满一致的自交系种子，置于28℃培养箱中发芽，萌发后在每个自交系中挑选出长势一致并且生长旺盛的种子播种于土壤中，每盆播种5株，每个材料播种8盆，待生长至三叶一心期，每个材料各取4盆分别置于24℃和6℃的培养箱中，24℃处理为对照组，48 h后取出，称量鲜重，并保存于冰盒内，测定生理生化指标。

1.3 指标的测定方法

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定采用紫光分光光度法[8]、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定和过氧化物酶（POD）活性测定采用于晶[9]的方法、丙二醛（MDA）含量测定采用杨德光[5]的方法、游离脯氨酸采用磺基水杨酸法测定[10-11]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[12]，采用蒽酮法测定可溶性糖含量[13-14]。

1.4 数据统计分析

试验图表用Excel 2010制作，使用SPSS 23.0软件进行显著性检验。显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 植株表型及叶片含水量变化分析

从图1A可以看出，在6℃处理48 h后，4个自交系材料叶片均出现萎蔫、下卷现象，其中东91较其它供试材料植株长势整齐，其余材料均出现少量植株倾斜；图1B显示，低温胁迫后C71、京33、东46与对照相比鲜重显著下降，而东91鲜重有下降但不显著，4个材料鲜重下降幅度分别为28.3%、16%、19.2%、9.1%。以上结果说明，低温胁迫后自交系东91耐低温能力可能要比其他材料表现好，能够很好适应环境变化。

图1 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片表型及鲜重分析Fig.1 The leaf phenotype and fresh weight analysis of different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.2 玉米苗期叶片膜质化程度分析

2.2.1 丙二醛（MDA）含量

从图2可以看出，6℃低温胁迫48 h后，自交系C71、京33、东91的丙二醛含量均显著上升，上升幅度分别为400%、200%、600%，而自交系东46与对照相比下降但不显著，下降幅度为20%。以上结果说明，东91和京33经低温胁迫后叶片组织过氧化程度较重。

图2 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片丙二醛（MDA）含量分析Fig.2 The content analysis of MDA in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.2.2 电导率分析

从图3可以看出，6℃处理48 h后，4个供试材料的电导率和对照相比变化均显著，其中自交系C71、东46与东91的叶片电导率均显著提高，分别增加16.1%、29.8%和34.3%，而京33电导率显著降低，降低幅度为20.3%。实验结果说明，低温胁迫导致细胞膜透性受到破坏，细胞内电解质外渗，其中C71电导率增加最小，分析其耐低温胁迫能力可能最好，京33的电导率较对照降低可能由实验误差引起。

图3 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片电导率分析Fig.3 The analysis of conductivity in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3 玉米苗期叶片保护酶活性分析

2.3.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

从图4可以看出，在6℃处理48 h后，4个玉米自交系品种的PAL活性与对照相比变化差异均显著，其中C71、京33、东46显著下降，分别下降了56.3%、21.2%和41%，而东91显著上升，上升61.2%。以上结果说明，自交系东91低温胁迫后，植株叶片PAL活性比较高，PAL能够提高植株的抗逆性，所以东91可能更能够适应低温环境。

图4 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性分析Fig.4 The activity analysis of PAL in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性

从图5可以看出，在6℃处理48 h后，4个玉米自交系品种的SOD活性与对照相比变化均显著上升。自交系C71、京33、东46、东91的SOD活性分别上升31.5%、42.5%、96.6%、27.4%。以上结果说明，东46低温胁迫后，植株叶片SOD活性上升幅度最大，分析其可能对低温响应最敏感。

图5 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性比较Fig.5 The activity analysis of SOD in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3.3 过氧化物酶（POD）活性

从图6可以看出，6℃处理48 h后，4个玉米自交系品种的POD活性与对照相比变化均显著，其中京33、东46和东91显著上升，上升幅度分别为184.6%、85.7%、59.1%，而C71显著下降，下降幅度为45.8%。以上结果说明，自交系京33经低温胁迫后POD活性提高最显著，仅从指标考虑分析其耐低温能力可能较其他自交系表现好。

图6 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片过氧化物酶（POD）活性分析Fig.6 The activity analysis of POD in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4 玉米苗期叶片渗透调节物质含量分析

2.4.1 脯氨酸含量

从图7可以看出，6℃低温胁迫48 h后，和对照相比自交系C71、京33和东91叶片脯氨酸含量均有所增加，分别提高112.4%、76.2%和105.6%，且差异显著，而自交系东46的脯氨酸含量降低6.4%，但差异不显著。该结果说明，自交系C71经低温胁迫后脯氨酸含量增加显著，其耐低温能力可能较好，其次为东91。

图7 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片游离脯氨酸含量分析Fig.7 The content analysis of proline in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4.2 可溶性糖含量

由图8可知，和对照相比6℃低温胁迫48 h后，自交系京33和东91可溶性糖含量均有所增加，分别提高36.0%和9.7%，其中京33差异显著而东91差异不显著，而C71与东46可溶性糖含量分别降低54.9%和72.9%，且差异显著。该结果说明，根据可溶性糖含量变化分析，京33和东91耐低温能力可能要优于C71和东46。

图8 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片可溶性糖含量分析Fig.8 The content analysis of soluble sugar in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4.3 可溶性蛋白含量

从图9可以看出，和对照相比6℃低温胁迫48 h后，4个自交系材料的可溶性蛋白含量均有所提高，C71、京33、东46和东91分别提高56.2%、44.4%、22.9%和43.1%，且差异均显著，增加量由大到小依次为C71>京33>东91>东46。仅根据可溶性蛋白含量分析，自交系C71的耐低温能力可能要好于其他供试材料。

图9 6℃与24℃处理后不同玉米自交系苗期叶片可溶性蛋白含量分析Fig.9 The content analysis of soluble protein in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

3 讨论

低温胁迫对植物生理生化的响应比较复杂，涉及细胞膜系统稳定、渗透调节物质以及抗氧化酶活性等变化[15]。

丙二醛（MDA）含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，MDA在植物中的含量多少也可以作为判断植株抗低温能力的指标之一[16]。黄伟超等[17]研究表明，低温胁迫下，叶片内的丙二醛（MDA）含量会明显升高。研究与前人研究结果基本一致，随着低温时间的加长，其MDA含量上升，细胞膜质过氧化程度逐渐加重，但自交系东46的MDA含量明显低于其他自交系，分析其可能耐低温能力强。

通过植物细胞外渗透液导电性的差异能确定膜透性的大小，推测膜的受伤程度与对寒冷抗性强弱。杨猛[18]的实验发现耐冷性弱的自交系相对电导率上升幅度较大，说明低温的伤害往往作用于质膜，使质膜的选择透过性发生改变或丧失，导致溶质外渗，因此质膜的透性变化可显示细胞膜结构和功能的受损程度。有研究[19]认为抗寒性越强的细胞细胞质膜的透性在低温条件下增加的越小，也就是说耐低温的品种电导率增加的幅度小，从试验中发现4个自交系的电导率变化均极为显著，但京33的增加量较少，说明其耐低温能力可能较强。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）能够将苯丙氨酸催化转化为肉桂酸，在农业工业中，肉桂酸可以作为生长促进剂和长效杀菌剂，在植物体内抵御外界不良环境的迫害，所以苯丙氨酸解氨酶的活性增强进而可以提高植物的抗逆性[20]。研究与范树国等[21]的研究结果相似，玉米幼苗的PAL活性在低温条件下增强，实验中，C71、京33、东46品种与对照比较均呈下降趋势，其中自交系东91苯丙氨酸解氨酶活性最高，说明自交系东91的耐低温性可能较强。

超氧化物歧化酶（SOD）作为抗氧化系统的第一道防线，能够清除植物体内的ROS（活性氧），大量的实验显示SOD可有效提高植物的抗逆性，对细胞起着重要的保护作用，同时抗性品种也可以通过SOD酶活性指标辅助选择[22]。张宇婷等[23]研究表明，在逆境胁迫下，植物体内的SOD活性显著增强以清除大量的活性氧，维持植物正常生理活动。研究与前人的研究结果相似，在低温条件下，各玉米自交系苗期叶片超氧化物歧化酶活性与对照相比均呈上升趋势，其中C71超氧化物歧化酶活性最高，说明C71的耐低温性可能较强。

过氧化物酶（POD）是生物界广泛存在的、在植物体内活性较高的一种保护酶，是酶保护系统中缺一不可的重要组成部分，它与植物的氧化作用、呼吸作用和生长素在体内的化学作用休戚相关，对保护机体免受活性氧的损害可以起到十分重要的作用[24]。在逆境胁迫下，POD活性升高，清除植物体内的活性氧，保护植物体免受逆境环境的影响，研究与上述林植芳等[25]的研究结果相似，在低温条件下，京33、东46、东91品种与对照相比过氧化物酶活性均呈上升趋势，其中京33过氧化物酶活性上升幅度最大且最高。

在低温胁迫下SOD活性增加明显的自交系则POD活性不敏感，甚至降低，例如C71；而低温促使POD活性较高的自交系SOD的活性表现比较弱或者没有明显变化，从而证明了植物抗低温过程中保护酶系统的各种酶是相互协调配合起作用，而不是仅仅依靠某个酶的活性变化起到抗低温的效果。

植物受胁迫后合成亲水的脯氨酸和可溶性蛋白来维持植物细胞膨胀状态，因此脯氨酸和可溶性蛋白含量与植物胁迫耐受性密切相关。郝小琴等对玉米幼苗低温胁迫处理，结果发现脯氨酸含量逐渐增加[26]，实验结果也验证了该观点。在低温条件下，玉米的生长发育状态与环境因素的关系密切，游离脯氨酸含量增加可以保持生物大分子结构稳定，实验中6℃低温处理后C71的游离脯氨酸含量明显增加，说明其耐低温性可能较强。

可溶性糖作为光合作用的产物之一，可以合成纤维素组成细胞壁、转化组成其他有机物如核苷酸和核酸，分解产物是其他许多有机物的合成原料，植物为了适应低温、干旱等逆境条件，会主动积累可溶性糖来降低冰点和渗透势。可溶性糖是稳定原生质体与细胞膜的重要物质[27]，它的增加能够帮助植物细胞抵御逆境胁迫，试验中C71的可溶性糖含量显著下降，说明C71的耐低温能力可能较弱。自交系C71与东46出现可溶性糖含量降低的原因可能与其耐寒性较弱有关，这两种自交系在6℃低温处理后受到伤害，难以正常生产可溶性糖从而导致其含量降低。

蛋白质是构成原生质的基础物质，在作物的生长发育中，细胞的增长分裂与新细胞的形成必须有蛋白质的参与。玉米叶片中的可溶性蛋白能够帮助其减弱外界环境胁迫对玉米的损伤，可溶性蛋白含量增加可以保持细胞膜结构的稳定性并且增加其对外界环境胁迫的抗性[29]，而实验发现京33自交系的可溶性蛋白含量增加的最为显著，所以推测京33品种的抗寒性可能较强。

4 结论

试验结果可以得出，自交系东91的鲜重下降幅度最小，PAL活性上升幅度最大，SOD活性和POD活性均呈显著上升趋势，比其他品种具有一定的耐低温优势，自交系东91综合各项指标略优于自交系京33，自交系京33综合各项指标优于东46、C71，综合东46各项指标除MDA含量比其他3个品种低之外，均没有明显优势。基于以上分析得出各品种耐低温性强弱为东91>京33>C71>东46，该结果与前期萌芽期低温胁迫鉴定结果具有一致性。实验初步证明了玉米苗期叶片在低温胁迫后保护酶活性和丙二醛含量会有所变化，并会对不良环境起到一定的抵抗作用，玉米苗期耐低温性不是某一种酶或代谢产物决定的，是多个生理生化反应的综合表现，选育苗期抗低温玉米品种是一个复杂的过程，还需进一步探讨。