竹叶花椒ZaGGPPS基因克隆与表达分析

关淑文 王毅 郝佳波 原晓龙 陆斌 李贤忠

摘 要： 為了揭示竹叶花椒萜类代谢的分子机理及嫁接对其风味的影响，该文依据转录组数据设计特异性引物，采用RT-PCR方法从竹叶花椒（Zanthoxylum armatum）中克隆得到一个全新的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPPS）基因的全长cDNA序列，命名为ZaGGPPS，并利用NCBI、ProParam、SignalP 4.1 server、DNAMAN和MEGA 7.0软件对ZaGGPPS基因进行生物信息学分析，并比较其在嫁接树和实生树中的表达量。结果表明：ZaGGPPS包含完整的cDNA开放阅读框（OFR），由1 086 bp组成，编码361个氨基酸。其蛋白的相对分子量为39 079.14 Da，理论等电点pI为6.38。Blast比对结果显示该蛋白质属于GGPPS家族蛋白，含有2个GGPPS蛋白特有的天冬氨酸富集基序，分别是“DDXXXXD”和“DDXXD”，以及5个特征性功能结构域。系统进化树结果显示竹叶花椒与芸香科植物甜橙（Citrus sinensis）、克里曼丁桔（C. clementina）、柚子（C. maxima）等亲缘关系较近。荧光定量PCR检测显示，ZaGGPPS基因在竹叶花椒中的表达量从高到低分别为实生树的叶、嫁接树的叶、实生树的茎、嫁接树的茎。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是竹叶花椒萜类化合物生物合成途径中的关键酶，通过嫁接可影响ZaGGPPS基因在叶和茎中的表达量。该文对竹叶花椒ZaGGPPS基因进行了克隆与分析，为后续深入研究竹叶花椒香气形成的分子机理及利用分子生物学手段选育优良品种提供理论依据。

关键词： 竹叶花椒， 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶， 克隆， 生物信息学分析

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0598-08

Abstract： In order to reveal the molecular mechanism of terpenoid metabolism in Zanthoxylum armatum and the effect of grafting on its flavor， we designed specific primers based on transcriptome data and cloned a novel full-length cDNA sequence of geranylgeranyl pyrophosphate synthase （GGPPS） gene from Z. armatum by RT-PCR， and named ZaGGPPS. We analyzed the ZaGGPPS gene by using NCBI， ProParam， SignalP 4.1 server， DNAMAN and MEGA 7.0 softwares. The expression of ZaGGPPS gene in grafted and seedling trees were compared. The results were as follows： ZaGGPPS contained a complete open reading frame （OFR）， consisting of 1 086 bp， encoding 361 amino acids. The relative molecular weight of the protein was 39 079.14 Da and the theoretical isoelectric point pI was 6.38. Blast comparison results showed that the protein belonged to the GGPPS family and contains two specific aspartic acid enrichment motifs， namely “DDXXXXD” and “DDXXD”， and five characteristic functional domains. Phylogenetic tree results showed that Z. armatum had close relationships with sweet orange （Citrus sinensis）， clementine mandarin （C. clementina） and pomelo （C. maxima）. Fluorescence quantitative PCR showed that the expression level of ZaGGPPS gene in Zanthoxylum armatum ranged from high to low as follows： leaf of seedling tree， leaf of grafted tree， stem of seedling tree and stem of grafted tree. Geranylgeranyl pyrophosphate synthase was a key enzyme in terpenoid biosynthesis pathway of Z. armatum， and grafting can affect the expression of ZaGGPPS gene in leaves and stems. The cloning and analysis of ZaGGPPS gene of Z. armatum provides theoretical basis for further study on the molecular mechanism of aroma formation of Z. armatum and selection of excellent varieties by molecular biological means.

Key words： Zanthoxylum armatum， geranylgeranyl pyrophosphate synthase （GGPPS）， cloning， bioinformatics

蕓香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）植物在世界上约有250种，其中我国有39种，14变种（杜丽君等， 2013）。常见的有竹叶花椒（Zanthoxylum armatum）、青花椒（Z. schinifolium）和红花椒（Z. bungeanum）（陈茜等， 2018）。竹叶花椒广泛分布于贵州、广西、云南等地，具有重要的经济价值和生态效益，其果实可作为食用调料、药材等，而且根系发达、耐干旱贫瘠（张云等， 2010; 王景燕等， 2016）。因此，西部经济落后且干旱地区将栽植竹叶花椒作为解决农民劳动就业和增收致富的重要途径（舒正悦等， 2018）。

竹叶花椒的挥发油是其香味物质的表征成分，而竹叶花椒的挥发油中有67.122%是萜类化合物，包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-石竹烯、大根香叶烯等物质，因此，萜类化合物是竹叶花椒香气的重要组分（张云等， 2010）。以异戊二烯为结构单元的萜类化合物是植物代谢产物中数量最多的一类，其还参与植物的多种生理生化活动，如呼吸作用、光合作用、生长发育、防御、信号传导、繁殖等，其中部分萜类化合物具有重要的经济价值和药用价值 （齐小琼等， 2016）。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase， GGPPS）在萜类化合物生物合成途径中起着关键作用（魏攀等， 2016）。植物萜类化合物合成途径分两个阶段，首先是经甲基赤鲜糖醇磷酸途径（methyl-erythritol-phosph-ate， MEP）和甲羟戊酸途径（mevalonic acid， MVA）生成二甲烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl diphosphate， DMAPP）和异戊烯基焦磷酸（isopenteny pyrophosphate， IPP），然后GGPPS可催化三个不同的反应，分别是GGPPS催化1分子法尼基焦磷酸（famesylpyrophosphate， FPP）和1分子IPP;GGPPS催化1分子牻牛儿基焦磷酸（geranyl pyrophosphate， GPP）和2分子IPP;GGPPS催化1分子DMAPP和3分子IPP。三个反应最后都生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP） （姚雪倩等， 2017）。GGPP不仅是控制植物代谢中“碳流”方向的类异戊二烯化合物，而且还是众多化合物的通用前体，可在不同的酶促反应下参与生成多萜醇、赤霉素、叶绿素、脱落酸、类胡萝卜素、辅酶Q、独脚金内酯、多酚、维生素E、维生素K等物质，同时研究发现其还参与催化蛋白的异戊二烯化 （Yamamura et al.， 2014; 李泽锋等， 2015; 张萌等， 2015; 韩立敏， 2015）。因此，GGPPS在植物萜类化合物的合成中扮演着重要角色。李锋等（2019）发现在NtGGPPS1基因上调的烟草中，二萜类化合物与质体色素的含量均有所增加;魏攀等（2016）发现NtGGPPS1基因被特异性沉默后的普通烟草K326表现出植株矮小、生长缓慢、质体色素含量低、花期延迟等特点（魏攀等， 2016）。目前人们已在芥蓝（薛生玲等， 2018）、烟草（魏攀等， 2016）、茶树（姚雪倩等， 2017）、篦子三尖杉（齐小琼等， 2016）、艾纳香（夏奇峰等， 2016）等多种植物中克隆得到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，但尚未见到有关竹叶花椒ZaGGPPS基因的报道。本研究对竹叶花椒ZaGGPPS基因进行克隆与分析，为后续深入研究竹叶花椒香气形成的分子机理及利用分子生物学手段选育优良品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

材料：于云南省林业科学院树木园（102°44′42.57″ E， 25°08′50.67″ N）采集竹叶花椒嫁接树和实生树嫩梢上的叶和茎，用液氮保存带回实验室，放在-80 ℃冰箱中。

试剂和仪器：HiFiDNA聚合酶（北京全式金）;pUMT载体、T4连接酶、感受态细胞DH5α订购于生工生物工程（上海）股份有限公司;RNA提取试剂盒（Qiagen）;质粒提取试剂盒（康为世纪）;Super RT试剂盒（Takara）。PCR仪（Bio-Rad）、实时荧光定量PCR仪（ABI）、离心机（Backman）。

1.2 RNA提取与cDNA合成

将竹叶花椒的实生树和嫁接树的叶、茎放到液氮中研磨为粉末后，采用植物RNA提取试剂盒提取竹叶花椒叶和茎总RNA，其操作按照试剂盒说明书进行，RNA质量检测使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳完成，检测RNA浓度则使用NanoDropTM 2000。选择较完整，浓度适宜的RNA，根据制造商的说明，使用反转录试剂盒以1 g总RNA进行cDNA合成，并置于-20 ℃冰箱中保存备用。其余的RNA置于-80 ℃冰箱中。

1.3 ZaGGPPS基因的克隆

采用甜橙（Citrus sinensis， NCBI登录号： XP_006466719.1）的GGPPS基因为模板，本地BLAST搜索竹叶花椒的转录组数据，得到竹叶花椒的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（ZaGGPPS）序列，以该序列为依据，设计特异引物（ZaGGPPS1F： 5′-ATGACTTGTGTGAATATCGG-3′; ZaGGPPS1R： 5′-TCAATTCTGCCTATAAGCAA-3′）。用竹叶花椒嫁接树和实生树嫩梢的cDNA为模板，ZaGGPPS1F和 ZaGGPPS1R为引物，以HiFiDNA聚合酶进行扩增得到ZaGGPPS全基因片段。经过电泳检测后将目的片段连接到pUMT载体上，经PCR检测，送往生工基因进行测序。

1.4 ZaGGPPS基因蛋白序列分析

使用NCBI上的ORF Finder分析获得的竹叶花椒牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（ZaGGPPS）的cDNA序列，得到蛋白氨基酸序列，并用ProParam预测其蛋白的理化性质;用SignalP 4.1 server预测该蛋白有无信号肽;先通过NCBI对牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的蛋白氨基酸序列进行序列搜索，然后选择与ZaGGPPS蛋白序列同源性较高的植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶蛋白序列，再利用DNAMAN将其与竹叶花椒GGPPS蛋白序列进行相似度比对，最后利用MEGA 7.0构建系统进化树。

1.5 基因的转录模式分析

成功合成cDNA第一条链后，以TZaGGPPSF （5′-ACGCCAAAACTTAAACGCCG-3′）和TZaGGPPSR （5′-GAGAGTTTCTTCTTTGGTAA-3′）作为特异引物，且以ubiquitins（NCBI登录号： MK953729）作为内参基因，经荧光定量PCR检测竹叶花椒ZaGGPPS基因在嫁接树茎、嫁接树叶、实生树茎和实生树叶中的具体表达情况。用SYBR Green （invitrogen）检测特异引物的PCR产物。25 L反应体系的可选参数如下：2×SYBR绿色主混合物12.5 L，上下游引物（10 m·L-1）0.5 L，模板（cDNA）1 L，ddH2O 10.5 L。使用PCR热循环仪（ABI 7300; 应用生物系统， Foster City， CA， USA）。PCR反应程序：变性程序（95 ℃， 10 min），放大定量程序重复45次（95 ℃， 15 s; 57 ℃， 10 s; 72 ℃， 15 s; 单次荧光测量），熔化曲线程序（60 ℃至95 ℃， 加热速度0.1 ℃， 连续荧光测量），最后冷却至40 ℃。以延伸因子1-alpha （EF1a）基因作为基因正常表达的内部调控因子，通过qPCR分析每个样品的至少两个独立的生物学重复和每个生物学重复的三个技术重复，以确保再现性和可靠性。用比较Ct值法计算相对基因表达量f，其中f=2-△△Ct，△△Ct=（试验目标基因组的Ct值-试验组参考基因的Ct值）-（对照组目标基因的Ct值-对照组参考基因的Ct值）。

2 结果与分析

2.1 RNA提取和ZaGGPPS基因克隆

利用植物总RNA提取试剂盒成功提取竹叶花椒嫁接树和实生树嫩梢的总RNA后，反转录得到cDNA。以ZaGGPPS1F和ZaGGPPS1R作为特异引物，成功克隆得到竹叶花椒ZaGGPPS基因（NCBI登錄号： MK953731）。在NCBI ORF Finder软件上对测序结果分析显示，ZaGGPPS基因具有完整的全长1 086 bp的cDNA开放阅读框（ORF），编码361个氨基酸 （图1）。

2.2 竹叶花椒ZaGGPPS基因蛋白序列分析

用在线程序NCBI ORF Finder预测ZaGGPPS基因的开放阅读框，ProParam预测其蛋白的理化性质。结果显示：该蛋白由361个氨基酸残基组成，其分子量为39 079.14 Da，理论等电点pI为6.38;将ZaGGPPS蛋白序列放在美国国家生物技术信息中心（NCBI）上进行比对，发现推断得到的 361个氨基酸序列与已知功能的甜橙（sweet orange， Citrus sinensis）、克里曼丁桔（clementine mandarin， C. clementina）、柚子（pomelo， C. maxima）和白梨（white pear， Pyrus bretschneideri）的GGPPS蛋白序列相似性较高，结果为ZaGGPPS蛋白序列与甜橙的CsGGPPS蛋白序列相似性为82.32%，与克里曼丁桔的CcGGPPS蛋白序列相似性为82.04%，与柚子的CmGGPPS蛋白序列相似性为82.04%，与白梨的PbGGPPS蛋白序列相似性为73.53%。对竹叶花椒ZaGGPPS蛋白序列分析发现，其含有2个GGPPS蛋白特有的保守区，即天冬氨酸富集基序“DDXXXXD”和“DDXXD”（X为任意氨基酸），并且发现其含有聚异戊二烯合成酶的5个特征性功能结构域（Ⅰ-Ⅴ） （图2）。

将推导出来的ZaGGPPS蛋白序列放在NCBI上进行比对后，可得到其他植物的GGPPS蛋白序列，用MEGA 7.0中自带的Cluster W进行蛋白序列多重比对，用Neighbor-joining算法（自检举1 000次），绘制出竹叶花椒GGPPS与其他植物GGPPS的进化树（图3）。结果显示竹叶花椒ZaGGPPS蛋白与甜橙、克里曼丁桔、柚子的GGPPS蛋白聚为一类（图2）。

2.3 竹叶花椒ZaGGPPS基因的转录模式分析

采集竹叶花椒嫁接树和实生树的嫩梢，用液氮保存带回实验室，用植物总RNA提取试剂盒提取竹叶花椒嫁接树茎、嫁接树叶、实生树茎和实生树叶的总RNA并反转录成cDNA。用特异引物TZaGGPPSF 和 TZaGGPPSR 检测在嫁接树叶、嫁接树茎、实生树叶和实生树茎中ZaGGPPS基因的具体表达情况（图4），结果显示，ZaGGPPS基因在竹叶花椒实生树的叶中表达量最高，其次是嫁接树的叶，再到实生树的茎，在嫁接树的茎中表达量最低。

3 讨论与结论

研究表明，尽管GGPPS基因是个大家族，且各基因存在明显分化，如同源基因编码蛋白的亚细胞定位、表达模式等存在差异， 但仍有部分同源基因对萜类代谢起着关键的调控作用，能显著影响植物体内萜类化合物的合成（王中等， 2018）。蛋白序列多重比对显示竹叶花椒GGPPS与其他植物GGPPS的相似性较高，该氨基酸序列含有GGPPS共有的5个保守结构域，以及FARM（the first aspartate-rich motif）和SARM（the second aspartate-rich motif）这两个特异功能域，分别是“DDLPCMD”和“DDILD”，其中FARM和SARM是GGPPS催化Mg2+ 桥与底物分子二磷酸基团结合的关键活性位点（Song & Poulter， 1994; Hemmi et al.， 2003）。Kai et al.（2010）和Wang et al.（2010）的研究发现，丹参SmGGPPS基因和榛子CgGGPPS基因在叶中的表达量均高于茎中的表达量，而本研究经转录模式分析可看出无论是在嫁接树还是实生树中，ZaGGPPS基因在叶的表达量都比在茎中高，这与前人研究结果相一致。然而，嫁接过后竹叶花椒的叶和茎相对实生树来说，ZaGGPPS基因分别下调，从而推测嫁接可影响竹叶花椒ZaGGPPS基因的表达。

花椒的主要风味是麻味和香味，而其香味物质的表征成分是挥发油，包含了醇类、烯类、醛类、酯类、酮类等挥发性物质，同时挥发油的成分还是评价花椒品质的主要指标。竹叶花椒香气成分中的萜类物质以单萜居多，其次是二萜，包括柠檬烯、桉树脑、萜品醇、水芹烯、蒎烯、月桂烯、桧烯、大根香叶烯、石竹烯等（陈茜等， 2018）。当前，关于牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶在植物香味领域的研究多集中在烟草和茶树这两类植物中，如林世峰等（2014）发现烟叶中类胡萝卜素、二萜类化合物的含量增加，其香气量也会相应增加;姚雪倩等（2017）发现铁观音CsGGPPS基因在芽叶的相对表达量总体随芽叶的成熟度增加而增加，从而很好地解释了在生产加工上需采摘一定成熟度芽叶的原因;王赞等（2019）通过研究推测茶树CsGGDPS7 基因与其萜类香气化合物的合成关系密切。目前尚未见到有关GGPPS基因对竹叶花椒香味影响的相关研究。本研究对竹叶花椒ZaGGPPS基因进行克隆与分析，为今后深入研究竹叶花椒香气形成的分子机理、利用基因工程手段调控竹叶花椒萜类化合物的含量及改善果皮香气品质提供理论依据。

花椒的香气成分具有较高的经济价值和药用价值。在制药方面，因其香气成分具有促进药物透皮吸收的功效，故可将其加入到一些外用制剂中，以促进药物吸收;在食品方面，花椒香气成分可作为无毒无害的食品防腐剂，以代替苯甲酸钠、山梨酸钾等物质;在农业方面，花椒香气成分可有效抑制病虫害的繁殖，以减少化学农药的使用（陈茜等， 2018）。因此，在加强花椒香气成分基础研究的同时，也应加强其产品的开发与利用，以促进生态与经济的和谐发展。

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（责任编辑 周翠鸣）