洋甘菊总黄酮成分分析及其对胰脂肪酶的抑制作用

米热阿依·麦麦提 ，王 莹，赵生俊*，兰 卫

(1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830002；2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

肥胖症是一种常见的脂质代谢紊乱综合征，它不仅是单纯的体重增加， 而且与糖尿病、高血压、血脂异常、癌症等慢性病有密切关系[1-2]。肥胖正成为全球性的首要健康问题。随着人们生活水平的提高，肥胖症发病率逐年上升，人们对其关注度也越来越高[3]。造成肥胖的最主要原因是，饮食中摄入超过机体本身所需要的能量，如甘油三酯[4]。胰脂肪酶(pancreatic lipase,PL)是一种由动物或人的胰腺分泌的水溶性脂肪分解酶，在甘油三酯的消化中发挥着重要作用，它可以消化食物中50%～70%的膳食脂肪[5]，是人体主要的脂肪分解酶[6]。作为脂质吸收缓解的关键酶，胰脂肪酶在维持体内脂代谢平衡中发挥着极其重要的作用。胰脂肪酶抑制剂通过抑制胰脂肪酶的活性可有效抑制膳食中脂肪的吸收，从而达到治疗肥胖的目的[7]。 Orlistat是FDA批准的减肥药，于20世纪90年代后期投放市场，当时被认为是对抗肥胖的关键武器；但是，由于严重的不良反应，如脂肪和油性大便、恶心、呕吐、肠胃气胀、肝损伤等，已经出现了安全问题[8]。因此，有必要找到更有效、更安全的胰脂肪酶抑制剂，作为预防和治疗肥胖的替代药物。

洋甘菊(MatricariachamomillaL.)，又称母菊或德国洋甘菊，是菊科(Compositae)母菊属(Matricaria)一年生草本植物[9]，甘香微苦，主产于我国新疆南疆地区。中药化学成分研究表明，洋甘菊主要含有挥发油类、黄酮类、多糖类、香豆素类、皂苷类等化学成分[10-11]。其中，黄酮类化合物是洋甘菊主要的药理活性成分，主要有槲皮素、芹菜素、木犀草素、芦丁等，具有抗菌、抗氧化、消炎、抗癌、抗心血管病等多种药理作用[12-13]。由于洋甘菊独特的药理作用，其研究和应用受到研究者的广泛关注。兰卫等[14-15]研究了德国洋甘菊对实验性高血脂症大鼠的降脂作用以及维药洋甘菊体外抑制宫颈癌HeLa细胞增殖作用；马红梅等[16]研究了洋甘菊提取物对2型糖尿病小鼠的降血糖作用及抗氧化作用；郭玉婷等[17]研究了维药洋甘菊提取物对原发性高血压大鼠的降压作用；叶琦等[18]研究了异槲皮苷等6个洋甘菊黄酮成分对DPPH自由基的清除活性；赵一帆[19]从洋甘菊中分离出39个化合物，鉴定出34个化合物，非黄酮类成分居多。因此，作者采用回流法提取洋甘菊总黄酮，经D-101大孔吸附树脂对粗提物进行纯化，采用液相色谱飞行时间质谱联用仪(LC-TOF-MS/MS)对纯化的洋甘菊总黄酮进行成分分析，以4-甲基伞形油酸酯(4-MUO)为底物，研究洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用，为洋甘菊总黄酮的质量控制提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

洋甘菊药材，采于新疆医科大学中医学院药材基地，经新疆医科大学第四附属医院李永和主任中药师鉴定，确定为母菊属一年生草本植物德国洋甘菊(MatricariachamomillaL.)。

无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、一水合物柠檬酸(C6H8O7·H2O)，北京酷来宝科技有限公司；甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)、二甲亚砜(色谱级)、甲酸(色谱级)、肉桂酸-3-苯丙酯、4-甲基伞形油酸酯(4-MUO，探针底物)、4-甲基伞形酮(4-MU)、脂肪酶，美国Sigma-Aldrich公司；0.1 mol·L-1柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH值7.4)，室温配制，保存。

SpectraMax iD3型多模式酶标仪(SpectraMax®iD3)，奥地利Molecular Devices；振荡恒温金属浴、低温高速离心机，美国Thermo Fisher Scientific； LC-30AT型超快速液相色谱仪(UFLC)，日本Shimadzu；AB SCIEX Triple TOF 4600型三重四极杆质谱仪，美国AB Sciex。

1.2 方法

1.2.1 洋甘菊总黄酮的提取

取洋甘菊粉末，加入12倍体积的70%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液，浓缩；用D-101大孔吸附树脂纯化，收集洗脱液，60 ℃旋转蒸发除去乙醇，干燥，即得洋甘菊总黄酮，含量为56%(UV法)。

1.2.2 洋甘菊总黄酮的成分分析

洋甘菊总黄酮样品溶液的制备：精密称取洋甘菊总黄酮粉末15 mg，加入1 mL甲醇溶解，超声(功率100 W，40 kHz)处理20 min，静置冷却至室温，稀释至3 mg·mL-1，置于低温高速离心机中12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，注入到液相瓶中待测。

色谱条件：C18色谱柱(2.0 mm×250 mm,5 μm)，柱温40 ℃，进样量3 μL，检测波长200～800 nm，流动相为0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，流速0.4 mL·min-1，洗脱梯度：0.01 min，95%A-5%B;2.0 min，95%A-5%B;30 min，55%A-45%B;45 min，5%A-95%B;50 min，95%A-5%B。

质谱条件：检测模式为ESI离子源(negative ion mode)，质谱参数见表1。

表1 质谱参数

1.2.3 胰脂肪酶活性测定

洋甘菊总黄酮样品溶液的配制：称取洋甘菊总黄酮粉末，用缓冲液配成浓度分别为50 mg·mL-1、20 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、1.56 mg·mL-1、0.78 mg·mL-1的样品溶液。

总反应体系200 μL：2 μL不同浓度的洋甘菊总黄酮样品溶液、2 μL 10 μg·mL-1胰脂肪酶溶液、194 μL 0.1 mol·L-1柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH值7.4)、2 μL 10 μmol·L-14-MUO溶液。首先，缓冲液、胰脂肪酶溶液和不同浓度洋甘菊总黄酮样品溶液在生理条件(pH值7.4、37 ℃)下混合孵育，然后加入4-MUO溶液开始反应。用酶标仪检测产物4-MU的荧光强度(激发波长340 nm，发射波长460 nm)。按下式计算胰脂肪酶的残余活性(%)：

式中：F1为待测体系荧光强度；F2为空白体系荧光强度。

1.3 数据处理

采用Peak View软件2.20(AB Sciex,USA)对质谱数据进行分析。采用Graph Pad Prism 7.0软件(Graph Pad Software,Inc.,USA)对胰脂肪酶抑制实验的IC50值进行非线性回归评估。

2 结果与讨论

2.1 洋甘菊总黄酮的成分分析

按1.2.2色谱和质谱条件，对洋甘菊总黄酮样品溶液进行LC-TOF-MS/MS检测，采用Peak View软件2.20对数据进行分析处理，得到总离子流图(图1)。结合高分辨质谱信息并参考相关文献对洋甘菊总黄酮进行成分分析，共鉴定出38个黄酮类化合物(表2)。

图1 洋甘菊总黄酮的LC-TOF-MS/MS总离子流图(负离子模式)

表2 洋甘菊总黄酮的成分分析

续表2

2.2 洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用

终浓度为1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、100 μg·mL-1的洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用如图2所示。

图2 洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用

由图2可以看出，洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用较强，当洋甘菊总黄酮浓度较低(≤1 μg·mL-1)时，胰脂肪酶的残余活性不超过50%。

为了定量分析洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用，采用不同浓度的洋甘菊总黄酮进行胰脂肪酶抑制实验，结果如图3所示。

图3 不同浓度洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用

由图3可以看出，洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶介导的4-MUO水解的IC50值为(1.09±0.08) μg·mL-1，表明洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶具有较强的抑制作用。

3 结论

采用液相色谱飞行时间质谱联用仪(LC-TOF-MS/MS)对纯化的洋甘菊总黄酮进行成分分析，共鉴定出38个黄酮类化合物，为洋甘菊总黄酮的质量控制提供了依据。胰脂肪酶抑制实验结果表明，洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶具有较强的抑制作用，IC50值为(1.09±0.08) μg·mL-1，是安全有效的胰脂肪酶抑制剂，有望成为预防和治疗肥胖的替代药物。本实验仅研究了洋甘菊总黄酮对胰脂肪酶的体外抑制效果，体内及药用效果还有待于进一步研究。