杜马斯燃烧定氮法和凯氏定氮法在蔬菜粗蛋白质含量检测中的比较

常 硕 张延国 刘广洋 许晓敏 黄晓冬 吕 军 徐东辉

〔中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部蔬菜质量安全控制重点实验室，农业农村部蔬菜产品质量安全风险评估实验室（北京），北京100081〕

粗蛋白质含量是评价食品品质的重要指标之一，选择一种优良的检测手段能更好地对食品品质作出准确、快速的评价。多年来人们不断创新与改进，建立了多种蛋白质检测方法，目前在国际上被广泛认可的检测方法主要有两种：凯氏定氮法（凯氏法）和杜马斯燃烧定氮法（杜马斯法）。凯氏法占据粗蛋白质分析领域的主导地位已经有100 多年，围绕其建立的各类食品中氮-蛋白质换算系数理论更是被誉为经典，能够快速高效地检出能被浓硫酸消解转化的铵态氮（有效消解蛋白质，却无法转化样品中的硝酸盐），经过蛋白质折算系数换算后，可以得到几近真值的结果（杨瑶 等，2018）。实际上这个结果是否代表了真正的蛋白质含量已不重要，重要的是凯氏法在贸易和科研等领域中起到的检测标杆作用，其操作简单、设备成本相对较低，直到今天仍被几乎所有国家和组织所认可。相对于凯氏法，杜马斯法则是在国际日趋严格的安全与环保要求下被重新重视的方法，该理论的提出甚至比凯氏法还早了50 多年，但当时的工业生产和技术水平限制了其发展。杜马斯法对样品采取高温通氧燃烧的方式，可将其中全部的氮素充分转化后定量，并同样使用凯氏蛋白质折算系数进行换算，因此检测结果更接近样品真实的总氮含量（梁世岳 等，2016；王铁良 等，2019）。

目前，采用杜马斯燃烧定氮原理的仪器设备和技术已日趋完善，在国际社会应用非常广泛，且该方法早已被美国、欧盟等很多国家和国际组织所认可（樊霞 等，2014；秦琳 等，2019），表1 列出了对杜马斯法认可的国家和组织及其所制定的标准。目前我国也将杜马斯法列为食品蛋白质检测的国标方法（GB 5009.5—2016），但在国内蔬菜检测领域的应用比例却不高，具备相关参考价值的文章并不多，因此有必要对凯氏法和杜马斯法进行验证和研究分析。本试验选择15 种常见蔬菜作为样品，分别采用凯氏法和杜马斯法进行粗蛋白质含量检测，通过对数据结果的研究分析，对两种检测方法进行比较，以期为蔬菜粗蛋白质检测方法的选择提供可靠的数据支撑和研究参考。

表1 一些国际组织出台的基于杜马斯燃烧定氮法的方法标准

1 材料与方法

1.1 样品采集和制备

样品采集：选取市场较常见的15种新鲜蔬菜，包括大白菜、普通白菜、青花菜、菠菜、番茄、辣椒、山药、马铃薯、姜、黄瓜、豌豆、萝卜、大蒜、豌豆苗、香菇。对于散装成堆样品采用分层采样，对于包装样品采用堆垛采样，每种样品采集量不少于3.5 kg。当单个个体大于0.5 kg 时，选择不少于10 个个体；单个个体大于1 kg 时，选择不少于5个个体。去除附着的泥土、腐烂和萎蔫茎叶，待用（NY/T 789—2004）。

缩分：取样本可食用部分（去除果柄、叶菜根部等），于清洁的聚乙烯塑料薄膜上，将其切碎并充分混匀，放入食品加工机中打碎成匀浆，取500 g 左右待用，其余匀浆倒入分装容器中，于-20 ℃冰箱中保存（NY/T 762—2004）。

干样制备：将匀浆倒入平铺有聚乙烯塑料薄膜的白搪瓷盘中，置于鼓风干燥箱中105 ℃加热15min 灭酶活，然后在60～70 ℃条件下干燥24～48 h，使用粉碎机粉碎，使全部样品通过40目筛，混合均匀后放置于干燥器内，待测。匀浆按GB 5009.3—2016 方法测定水分含量，用于鲜样粗蛋白质的换算。

1.2 主要设备

FOSS 2300 半自动凯氏定氮仪和配套20 位样品消化炉（丹麦FOSS 公司）；rapid N exceed 杜马斯定氮仪（德国Elementar公司），气体CO2（99.99%）和O2（99.99%）。

1.3 主要试剂

硼酸、浓硫酸、氢氧化钾（均为分析纯），盐酸标准滴定溶液（北京钢研纳克公司，0.100 0 mol·L-1），硫酸铵溶液〔中国医药（集团）上海化学试剂公司，氮含量1 mg·mL-1〕，D-天冬氨酸（Sigma公司，99%），凯氏催化剂片（丹麦FOSS 公司）。

1.4 检测方法

1.4.1 凯氏定氮法 样品检测：称取0.2～0.5 g（准确至0.001 g）蔬菜样品（依干基试样蛋白质含量适当增减，每种蔬菜平行称取6 份）于6 支消化管中，每支加入1 片凯氏催化剂片和8 mL 浓硫酸，置于消化炉上420 ℃消解2 h，待消解完全呈蓝绿色透明溶液后取下冷却至室温，使用凯氏定氮仪检测，记录蛋白质百分含量。

回收率试验：用移液器分别移取0.5、1、2、5、10 mL 硫酸铵溶液至消化管中，每个梯度做3 个平行，每支中加入1 片凯氏催化剂片和8 mL 浓硫酸，置于消化炉上420 ℃消解2 h，待消解完全呈蓝绿色透明溶液后取下冷却至室温，使用凯氏定氮仪检测，记录氮百分含量，计算回收率。

1.4.2 杜马斯燃烧定氮法 称取0.1～0.2 g（准确至0.001 g）样品于锡箔纸中，包裹密封样品后，通过手工冲压器挤出样品中空气，压紧包装样品，放置在自动进样器上待测。样品在935 ℃高温的燃烧管中加氧燃烧分解气化，形成混合气，在CO2载气推动下，干扰气体被吸收管、干燥管吸收，氮氧化物被全部还原为N2，最终通过热导检测器（TCD）检测，记录蛋白质百分含量。

回收率试验：称取0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 g（准确至0.001 g）天冬氨酸高纯物质于锡箔纸中，每个梯度做3 个平行，包裹密封样品后，通过手工冲压器挤出样品中空气，压紧包装样品，放置在自动进样器上待测，记录氮百分含量，计算回收率。

1.5 数据分析

对两种检测方法的参数进行比较；将检测结果按方法分成两组，进行线性回归拟合、CV、回收率和精密度分析；采用SPSS 软件对结果进行单因素ANOVA 方差分析，选择95%置信度作为统计学显著性检验的标准，并进一步对硝酸盐含量和结果差异性之间是否存在关联进行分析。

2 结果与分析

2.1 方法比较

表2 列出了凯氏法和杜马斯法的部分项目比较。首先，在试剂耗材和废弃物方面，凯氏法需要大量强酸、强碱等有害试剂，且需要高温强酸消解，易对人员健康及环境安全造成较大影响，在如今提倡全产业链可持续发展的大背景下，确实是不可取的。杜马斯法所使用的氧化催化剂（CuO、Pt）、吸附剂、还原剂（W）、干燥剂、锡箔纸包材以及CO2、O2气体，均是低毒、环保型试剂耗材，且试验产生的废弃物仅有N2、CO2等气体以及燃烧后的废渣，同样是安全无害的。其次，结合主要能耗设备的额定功率及使用时间估算能耗，凯氏法的消解和检测设备共耗电约58 kW·h，而杜马斯法设备仅耗电约22 kW·h，耗电量不到凯氏法的一半。最后，凯氏法的检测环节需要人员值守，并会积攒大量需要清洗的消化管，而杜马斯法的检测环节无人值守，且无需洗刷试验器皿，仅每进150个样品清理燃烧管废渣即可。由以上比较可以看出，杜马斯法相比凯氏法在安全、环保、能耗、工作效率和劳动强度方面具有非常明显的优势，尤其是当样品量较大时，采用杜马斯法能够大量释放人力资源，并在减少试验时间的同时，有效降低检测人员的劳动强度（Sader et al.，2004；黄远丽 等，2019）。

2.2 线性回归分析

采用杜马斯法和凯氏法对15 种蔬菜中粗蛋白质含量进行检测。以杜马斯法结果均值为横坐标，凯氏法结果均值为纵坐标，利用WPS 表格工具，按蔬菜种类拟合线性回归曲线（张秀莲 等，2015），回归方程：y=0.999 6x-0.032，R2=0.999 7，见图1。

从图1 中可以看出，杜马斯法测定的粗蛋白质含量范围在0.88%～7.42%，凯氏法在0.87%～7.38%之间，其中以粗蛋白质含量在1%～3%的蔬菜种类最多。两种方法的检测结果非常接近（D/K 范围1.00～1.08），呈显著线性相关（R2=0.999 7），说明检测结果趋向一致（表3）。

2.3 精密度和回收率分析

由表3 可见，杜马斯法CV在0.3%～2.1%之间，回收率在98.1%～101.9%之间；凯氏法CV在0.3%～1.4%之间，回收率在98.7%～99.8%之间。参考了实验室质量控制规范的技术要求（GB/T 27404—2008）后得出，两种方法均满足实验室质量控制规范对CV和回收率指标的技术确认要求（表4）。尽管每种蔬菜的D 值均不小于K 值（D/K 范围1.00～1.08），但两种方法间重复性条件下得到的独立测定结果D、K 间的精密度RSD 在0.4%～8.1% 之间，满足国标GB 5009.5—2016 的要求（RSD ＜10%），说明两种方法间的重现性良好，检测结果准确度高。

表4 检测方法确认的回收率和变异系数技术要求

2.4 方差分析

依据表3 中单因素方差分析结果可以看出：15 种蔬菜中有12 种的检测结果间不存在显著差异（P＞0.05），仅大白菜、普通白菜和菠菜的检测结果间存在显著差异（P＜0.05）。这种差异可能是由于蔬菜中硝态氮（硝酸盐）含量较高造成的（Waston &Galliher，2001）；郭望山和孟庆翔（2006）也得到一致的结果，同时他们还指出，在大部分低硝酸盐含量的植物源性蛋白质饲料中，两种方法的检测结果之间并不存在显著差异（P＞0.05）。本试验采用离子色谱检测了15 种蔬菜的硝酸盐含量后发现，结果差异最显著的3 种蔬菜均具有较高的硝酸盐含量水平，说明高水平硝酸盐含量的确是造成两种检测结果差异显著的原因，但硝酸盐含量与D-K 差值之间的线性关系并不显著（R2=0.718 7），见图2。除了大白菜外，具有高硝酸盐含量的菠菜并不具有相应更高的D-K（图中圆形区域），而硝酸盐含量最低的蔬菜反而具有较大的D-K（图中矩形区域）；另外，5 种高硝酸盐含量蔬菜（大白菜、普通白菜、菠菜、萝卜、山药）粗蛋白质含量的F值与硝酸盐含量之间呈低度线性相关（R2=0.329 4），见图3，说明硝态氮含量的高低并不是造成凯氏法和杜马斯法的粗蛋白质检测结果差异显著的唯一原因（郭晓旭 等，2008）。

表3 采用杜马斯法和凯氏法检测15 种蔬菜中粗蛋白质含量（n=6）

在对大量不同种类的农产品进行检测分析后发现，使用弹性的校正系数能够拉近两种方法的粗蛋白质含量差异（Simonne et al.，1997），并建议以0.89对应蔬菜，0.95 对应谷物，0.94 对应肉类，0.73 对应水果。可以看出，不同种类、不同基质样品的校正系数间差别较大。经验证后发现，系数0.89 对本试验涉及的大部分蔬菜有较好的校正效果，但并不完全适用。鉴于此，结合方法原理可以推测：蔬菜种类多、基质差别大，可能对检测方法的氮转化效率造成了一定影响，导致两种方法结果出现差异，但还需要进一步的研究确证。

3 结论

采用杜马斯法和凯氏法对常见的15 种蔬菜粗蛋白质含量进行检测。经比较分析得出：杜马斯法相比凯氏法有效减少了对人员健康和生态环境造成的危害，充分解放了人力、降低了试验能耗；两种方法的CV和回收率均能满足方法确认要求，结果间精密度满足国标要求；高硝态氮含量并不是造成检测结果差异显著的唯一原因，蔬菜基质对方法氮转化效率的影响可能是另一重要原因，但还需进一步研究确证。

综上所述，杜马斯燃烧定氮法和凯氏定氮法在蔬菜粗蛋白质检测领域均能提供准确、可靠的检测结果，其中杜马斯法在环保与检测效率方面更具优势。国内外文献结果表明，杜马斯法相比凯氏法确实有明显向好的发展趋势，但由于不同国家、地区对检测标准有不同的要求，所以短期内仍无法相互取代，可以预见两种方法还将在特定的领域长期互补、共存。