高效液相色谱-原子荧光光谱法应用于不同营养级鱼肌中汞的形态分析

高玉花, 黄杰超，张同生，陈 璐，林梵宇

(1.山东省物化探勘查院，山东 济南 250013；2.自然资源部 第三海洋研究所，福建 厦门 361005)

汞是一种常见的重金属，同时也是环境中毒性极强的重金属，被联合国环境规划署列为全球性污染物，是对人类和环境最具危害性的元素之一[1].汞具有多种形态，其中无机汞、甲基汞、乙基汞最受关注，无机汞和甲基汞在环境中含量较高，而甲基汞对人体的毒性在几种形态中是最大的，对人体内心血管系统、神经免疫系统等均有很大程度的危害，人体血液中甲基汞含量超过0.2 μg/g就会出现中毒症状[2].鱼类等水产品是人类接触汞中毒的重要传播途径，水体中的汞可通过食物链富集在鱼体上，导致鱼体蓄积的汞含量达水体中汞含量的10倍之多[3].日本熊本县水俣湾地区的居民因长期食用受甲基汞污染的鱼贝类而引起慢性甲基汞中毒[4].而环境中的无机汞在鱼类等水产品里富集的过程中也可转化为毒性较大的甲基汞.因此，如何对鱼类中汞的不同形态进行准确定量分析，以及比较不同地区、生境、营养级的鱼类中各形态汞含量的差异性和相关性具有重要意义.

近年来，对不同汞形态分析方法的建立以及改良已是分析化学研究领域中的一大热点.早期分析汞形态使用的是气相色谱法，其中我国早期有两个国标使用了这个方法，一个是《环境甲基汞的测定气相色谱法》(GB/T 17132—1997)，另一个是《水质烷基汞的测定气相色谱法》(GB/T 17204—93).由于缺乏选择性并且灵敏度低，此类方法在实际应用中逐渐被新方法所替代.其他的方法还有毛细管电泳法[5]和高效液相色谱法[6]等，相比较联用技术，这些单一的检测方法在灵敏度和抗干扰能力等方面存在劣势.目前，汞的形态分析大多是先用色谱等方法分离后再用具有元素选择性的检测手段进行测定[7].其中联用技术最具代表性的是高效液相色谱-电感耦合等离子质谱法[8]和高效液相色谱法-原子荧光光谱法[9]，这两种联用技术具有选择性高、灵敏度好、前处理简单等优点[10].由于高效液相色谱-电感耦合等离子质谱法仪器较昂贵，故本研究选择高效液相色谱-原子荧光光谱联用法(HPLC-AFS)进行二价汞、甲基汞、乙基汞三种形态的检测，通过对试验条件的优化，即改变流动相中甲醇的浓度、光电倍增管负高压、空心阴极灯电流、还原剂、载流的浓度来优化各组分的分离程度和响应值，提高检测精度.并以不同地区、不同营养级的鱼肌为样品，探究鱼肌上各形态汞富集情况，通过检测不同营养级鱼类的加标回收率，验证该方法应用于鱼肌中不同汞形态研究的可靠性，从而为开展环境污染检测以及探究形态汞在不同营养级生物体上的富集作用情况提供重要手段.

1 试验部分

1.1 仪器

BAF-2000四通道原子荧光光度计(北京宝德仪器有限公司)；汞空心阴极灯；BSA-100高效液相色谱泵(配自动进样阀，北京宝德仪器有限公司)；KQ5200DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Elga FlexⅡ超纯水仪(威立雅水处理技术上海有限公司).

1.2 试剂

氩气(99.999%)、盐酸、硼氢化钾、氢氧化钾、氢氧化钠、过硫酸钾、乙酸铵、甲醇、L-半胱氨酸(均为分析纯，采购于国药集团化学试剂有限公司)；汞标准溶液：二价汞[Hg(Ⅱ)，100.00 μg/mL，中国计量科学研究院，GBW(E)080124]，甲基汞[MeHg，(65.2±2.5) μg/g，中国计量科学院，GBW08675]，乙基汞[EtHg，(70.6±2.5) μg/g，中国计量科学院，GBW(E)081524].

1.3 试剂的配制

流动相：取950 mL超纯水于容量瓶中，加入50 mL甲醇，称取1.0 g半胱氨酸、4.48 g乙酸铵加入溶液中使其溶解.经0.45 μm有机滤膜抽滤后，于超声清洗器中超声脱气30 min，需现用现配.

载流：取950 mL超纯水于1 L容量瓶中并加入50 mL盐酸溶液制备成5%盐酸溶液.

还原剂：称取5.0 g硼氢化钾，使用氢氧化钠溶液(5 g/L)溶解并稀释至1 000 mL.

氧化剂：称取2.0 g过硫酸钾，使用氢氧化钠溶液(5 g/L)溶解并稀释至1 000 mL.

提取液：取900 mL超纯水于1 L容量瓶中，并加入100 mL盐酸溶液、10.0 g硫脲和1.5 g氯化钾，摇匀备用.

混合标准使用溶液：准确移取1 000 μL二价汞标准储备液、2 082 μL甲基汞标准溶液、2 048 μL乙基汞标准储备液于10 mL容量瓶中，使用流动相定容至刻度，配制三种形态汞混合溶液，其质量浓度为10 μg/mL.取100 μL三种形态汞混合溶液至10 mL容量瓶，使用流动相定容至刻度，配制三种形态汞(质量浓度均为100 μg/L)的混合标准储备溶液.分别移取混合标准储备液20、50、100、200、500、1 000 μL至10 mL容量瓶，使用流动相稀释至刻度，此混合标准工作溶液中三种形态汞的质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L.

1.4 仪器测量参数

1.4.1 色谱参数

色谱柱：Venusil MP C18分析柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司)；保护柱：Agela SH-100型(4.6 mm×2.1 mm)；流速1 mL/min；进样体积100 μL；柱温：25 ℃.

1.4.2 原子荧光光谱参数.

还原剂：0.5% KBH4+ 0.5% NaOH；氧化剂：0.2% K2S2O8+ 0.5% NaOH；载流：5% HCl；原子化器温度：200 ℃；原子化器高度：8 cm；空心阴极灯电流：30 mA；光电倍增管负高压：300 V；载气流量：400 mL/min；屏蔽气流量：800 mL/min.

1.5 鱼类样品的前处理

称取鱼肌样品(本文鱼肌样品均采自东海中南部海域)0.250 g(精确到0.001 g)到10 mL塑料离心管中，加入2 mL提取液，将样品置于超声波清洗器中超声提取15 min.超声完成后在4 ℃条件下，4 500 r/min离心30 min，取上层清液，再加2 mL提取液重复提取一次，合并两次提取液并用0.22 μm滤膜过滤.加入0.7 mL氨水中和pH至2～8，并经C18小柱净化处理，再用4 mL流动相分两次洗脱，最后定容至10 mL待上机测定[11].

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

通过对比液相色谱-原子荧光联用技术下测定不同形态汞的文献[1-8]发现，流动相中的有机溶剂选择多为甲醇和乙腈，为探究两种有机溶剂对形态汞峰型的影响，配制5%甲醇+1 g/L半胱氨酸+4.48 g乙酸铵和5%乙腈+1 g/L半胱氨酸+4.48 g乙酸铵两种不同流动相.由图1(a)可知，当流动相中有机溶剂为5%甲醇时，各形态汞分离程度良好，峰型完整，三种形态汞在8 min内完成出峰.由图1(b)可知当流动相中有机溶剂为5%乙腈时，Hg(Ⅱ)和MeHg分离程度不够，三种形态汞在6 min内完成出峰.比较两种流动相的有机溶剂，当选择甲醇时峰型更完整，并且乙腈的毒性比甲醇大，故本试验的流动相中的有机溶剂采用甲醇试剂.

图1 流动相中不同有机溶剂对汞三种形态峰型的影响(a) 5%甲醇的流动相， (b) 5%乙腈的流动相Fig.1 Effect of different organic solvents in mobile phase on peak shapes of three mercury species(a) 5% methanol, (b) 5% acetonitrile

流动相中甲醇浓度的高低影响各形态汞的分离程度.为探究影响程度，配制甲醇质量分数分别为3%、4%、5%、6%、7%的流动相进行测定，试验结果如图2所示.由图2可知，随着甲醇浓度的升高，Hg(Ⅱ)和MeHg之间距离越近，当甲醇的质量分数为3%、4%和5%时，三种形态汞的分离程度良好.当甲醇的质量分数提高到6%和7%时，Hg(Ⅱ)和MeHg有一定程度的重叠，Hg(Ⅱ)出峰不完全.另外，随着甲醇浓度的升高，三种形态汞的完成出峰时间降低.综合考虑形态汞的分离程度及时间成本，本试验流动相中的有机溶剂选择5%甲醇.

图2 不同甲醇浓度的流动相对汞三种形态峰型的影响(a) 3%甲醇的流动相，(b) 4%甲醇的流动相， (c) 5%甲醇的流动相，(d) 6%甲醇的流动相，(e) 7%甲醇的流动相Fig.2 Effect of different methanol concentrations in mobile phase on peak shapes of the three mercury species(a) 3% methanol, (b) 4% methanol, (c) 5% methanol, (d) 6% methanol, (e) 7% methanol

2.2 空心阴极灯电流的影响

空心阴极灯电流的大小，决定了激发光源的强弱.空心阴极灯灯电流越大则激发光源越强，灵敏度越高，但灯电流过大会导致灯的使用寿命降低.因此本试验选择灯电流值分别为10、20、30、40、50 mA时对形态汞信噪比的影响，通过计算可得5种不同灯电流的信噪比，结果如图3所示.由图3可知，随着灯电流的升高，信噪比先增大后减小，在灯电流为30 mA时信噪比最大.此外过高灯电流会降低空心阴极灯的使用寿命，故选择灯电流为30 mA.

图3 不同灯电流对信噪比的影响Fig.3 Effect of different lamp currents on signal-to-noise ratio

2.3 载流盐酸浓度的影响

载流盐酸的浓度对各汞形态产生的峰面积具有一定的影响.配制5组不同体积分数的盐酸溶液(3%、4%、5%、6%、7%)，对汞混合标准溶液进行测定，研究不同盐酸浓度对形态汞峰面积的影响，结果如图4所示.由图4可见，随着盐酸浓度的增加，形态汞的峰面积随之增加，在盐酸体积分数为5%时，三种形态汞的峰面积达到最高值，再增加盐酸浓度，峰面积出现下降趋势.因此，本文选用5%的盐酸溶液作为载流.

图4 不同盐酸体积分数对各形态汞峰面积的影响Fig.4 Effect of different hydrochloric acid volume fractions on peak area of different mercury species

2.4 硼氢化钾浓度的影响

不同形态的汞在硼氢化钾-盐酸体系下会反应生成氢化物，硼氢化钾的浓度很大程度上会影响氢化物的产生.配制不同浓度的硼氢化钾溶液(3、4、5、6、7 g/L)，对汞混合标准溶液进行测定，研究不同硼氢化钾浓度对形态汞峰面积的影响，结果如图5所示.由图5可见，较低浓度的硼氢化钾溶液在盐酸体系中氢化物的生成率低，导致各组分的峰面积偏低.随着硼氢化钾浓度的升高，汞氢化物的生成率升高，各组分的峰面积升高.当硼氢化钾的质量浓度达到5 g/L时，各组分的峰面积最大.但过高的硼氢化钾浓度会导致产生过量的氢气，在一定程度上稀释由各组分形成的原子蒸气，从而使各组分的峰面积降低.因此，本文采用硼氢化钾浓度为5 g/L.

图5 不同硼氢化钾浓度对各形态汞峰面积的影响Fig.5 Effect of different potassium borohydride concentration on peak area of different mercury species

2.5 三种形态汞标准样品的谱图

在光谱及氢化物发生条件优化的情况下，标准物质样品通过色谱柱进行分离后，先与载流汇合再与还原剂混合，发生氢化反应，原子荧光对三种形态汞产生的原子蒸气进行检测.采用C18柱对汞的形态进行分离，选用5%甲醇+1 g/L半胱氨酸+4.48 g乙酸铵作为流动相，流速1 mL/min，对质量浓度为10 μg/L的溶液进行测定，色谱峰如图6所示.在8 min之内，Hg(Ⅱ)、MeHg和EtHg依次出峰，实现完全分离，峰型较好，保留时间分别为2.624、3.822、7.138 min.

图6 优化条件下的标准谱图Fig.6 Standard spectrum under optimized conditions

2.6 三种形态汞的标准曲线、检出限及精密度

在优化条件下对汞形态标准混合溶液进行分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.以全流程空白样品作为基线，3倍信噪比(S/N≥3)为方法检出限，经样品添加试验确定鱼肌样品中三种形态汞的方法检出限.取5 μg/L的三种形态汞混合标准溶液，连续分别进样7次，计算相对标准偏差RSD，结果如表1所列.由表1可见，当三种形态汞混合标准溶液的质量浓度在0.2～10.0 μg/L之间时，该方法标准曲线线性关系良好，相关系数均大于0.999 9，检出限在0.39～0.82 μg/kg之间，RSD在0.87%～3.32%之间.

表1 优化试验条件下汞形态标准混合溶液的标准曲线、检出限及精密度Table 1 Standard curve, detection limit and precision of mercury form standard mixed solution under optimized experimental conditions

2.7 鱼肌样品准确度加标回收分析

选取三份鱼肌样品(分别为鳄齿鱼、麦氏犀鳕、大黄鱼)，对其汞形态含量进行测定.在三份水产品样品中分别加入0.05 mg/kg的汞混合标准溶液，结果如表2所列.由表2可见，Hg(Ⅱ)、MeHg、EtHg的加标回收率分别为96.0%～108.0%、86.0%～116.0%、84.0%～90.0%，表明该方法具有良好的准确度.试验结果说明使用此方法检测鱼肌样品中三种汞形态结果可靠.

表2 鱼肌样品的加标回收率Table 2 Recoveries of fish muscle samples

2.8 不同营养级鱼肌样品检测及加标回收试验

使用优化后的方法检测不同营养级的7组鱼肌样品.每种样品取三份(分别为鳄齿鱼、细条天竺鲷、麦氏犀鳕、大黄鱼、灰星鲨、皮氏叫姑鱼、宽尾斜齿鲨)的汞形态(结果如表3所列)，除细条天竺鲷的无机汞低于检出限，其余样品均检测到无机汞和甲基汞，所有样品中乙基汞含量均低于检出限，表明鱼肌样品中汞的形态主要以无机汞和甲基汞形式存在.根据《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB2762—2017)中规定，水产品动物及其制品中甲基汞的质量分数应不高于0.5 mg/kg，肉食性鱼类及其制品中甲基汞的质量分数应不高于1.0 mg/kg，所测7种样品中甲基汞含量均低于国家标准.结果中鳄齿鱼、麦氏犀鳕、大黄鱼、灰星鲨4种鱼肌样品随着营养级的升高，无机汞的含量升高，鳄齿鱼、麦氏犀鳕、大黄鱼、灰星鲨、宽尾斜齿鲨5种鱼肌样品随着营养级的升高，甲基汞的含量升高，表明不同形态汞随着鱼类营养级的升高存在富集作用.

表3 鱼肌样品中3种形态砷的测定结果Table 3 Determination results of three forms of arsenic in fish muscle samples

3 结论

通过改变液相色谱-原子荧光联用仪测试条件中的不同参数，各汞形态的分离程度最佳且检出限最优.利用优化后的条件测试三种形态汞标准样品及鱼肌样品，结果显示三种形态汞不同浓度下的标准溶液的标准曲线线性良好，精密度、检出限及加标回收率均满足分析方法的质量要求，且在鱼肌样品中发现其中汞元素以无机汞和甲基汞为主，且随着营养级的升高，不同汞形态存在富集作用.因此，在本文中的优化试验条件下，有利于液相色谱-原子荧光光谱联用技术在鱼肌样品中不同形态汞的测试.