美洲大蠊乙醇提取物对香烟引起小鼠肺脏氧化应激的干预效果研究

王 钦，伏 蓉，隋世燕，王惠玲，杨溢萍，蒋淋源，段 雷

(大理大学公共卫生学院；大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000)

吸烟已成为继高血压之后的全球第二号健康杀手，是导致心脑血管疾病、慢性阻塞性肺病和癌症等多种疾病的重要的危害因素，是引起肺癌最重要的危险因子(曹超，2012)。《中国吸烟危害健康报告》曾指出，吸烟者的平均寿命会比不吸烟者减少10年。有研究发现，被动吸烟者暴露在致癌物质中的风险比直接吸烟者高2.5倍(Andersonetal., 2012)。吸烟与机体氧化应激存在高相关性，能够诱导生命体抗氧化能力下降(曹超, 2012)。

自由基是生物体内涉及电子传递生化过程中的一种正常的代谢产物，是机体防御系统的组成部分，但是如果体内自由基产生的过多或者清除的过慢，多余的自由基会通过攻击细胞中的生命大分子物质，造成机体组织或细胞产生氧化应激，进而诱发疾病(张成桂等, 2010)。机体有两套防御系统来对抗氧化应激(Wathesetal., 2007)，其中抗氧化酶类，即机体内部的酶类抗氧化系统，属于一级防御系统，可以直接清除氧化应激产生的活性氧或抑制其氧化。包括过氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)等，常见的机体氧化应激标志物有丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)，它们能够反映机体脂质过氧化的程度(Bagchietal., 1997)。

美洲大蠊Periplanetaamericana,俗称蟑螂、小强，食性比较广泛，能够传播病菌，其粪便和分泌物中还含有致癌物质，属世界性害虫，但其体内具有抗肿瘤、促进血管增生和组织修复、抗菌、抗肝炎等活性物质(张成桂等，2010)。美洲大蠊乙醇提取物能够降低肝脏组织的MDA水平和提高SOD、GSH-Px的水平，提示美洲大蠊提取物能够抑制肝脏组织脂质过氧化反应的作用(隋世燕等，2017)。在力竭运动过程中，美洲大蠊提取物可以提高抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性，降低MDA的含量，同时又可刺激血管内皮氧化应激相关基因eNOS的表达，降低心肌组织中脂质过氧化的水平，延长了大鼠力竭运动时间，实现其抗运动性疲劳的目的(马俊等, 2015)；还能使大鼠血中MDA和NO含量显著减少(隋世燕等, 2017)。说明美洲大蠊乙醇提取物具有显著的抗氧化功能，但是，其在吸烟引起的小鼠肺氧化应激中是否有缓解效果还不清楚。

本研究将建立小鼠被动吸烟模型，然后给予不同浓度的美洲大蠊醇提物，分别检测小鼠血浆和肺脏中NO、MDA的含量以及SOD、CAT、GSH-Px的活力，并检测相关基因表达的水平，结合肺脏病理切片，探讨美洲大蠊醇提物对被动吸烟引起小鼠肺氧化应激的干预效果，为美洲大蠊乙醇提取物在这方面的生产应用和药物开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选择性成熟雌性KM小鼠28只，体质量18～22 g，实验动物来自第三军医大学，生产许可证号：SCXK(渝)2007-017，使用许可证号：SCXX(滇)2005-0010。适应性喂养3 d后随机分为4组，每组7只；由于试验期间灌胃操作不当死亡4只，采样时对照组6只、熏烟组5只、低剂量组7只、高剂量组6只。

1.1.2美洲大蠊醇提物的制取

美洲大蠊成虫处死后，晾干、粉碎，用15倍质量的95%乙醇进行冷浸提取3次，蒸发浓缩后的浸膏放入-40℃冰柜保存备用(隋世燕等, 2017)。

1.1.3香烟选择

选取云烟品牌中的“云烟(紫)”作为本实验用烟，烟长84 mm，软包装，每包20只，含焦油13 mg，尼古丁1.2 mg。

1.1.4实验处理

对照组处于正常环境饲养，实验开始后每天灌胃与实验组等比例的生理盐水，其余3组每天置于静式染毒柜内进行香烟暴露，根据相关文献(童寅等, 2015)，每天2次烟熏(12 ∶00和18 ∶00)，第1天每次2支，每隔3 d增加1次烟量(每次增加2支)，最高增加至每次8支不再增加。从烟熏开始至结束共计33 d，其中第8天、第15天不进行烟熏。具体方法：同时点燃单次用烟，燃烟开始时将小电风扇放置于距染毒柜一定距离，对准染毒柜底部小孔吹风至烟燃完(保证一定量的空气进入，防止烟熄或者小鼠窒息)，关闭风扇，再熏10 min。本研究所用静式染毒柜为桶状、半封闭的透明染毒柜，底部有一圆形小口(即毒物入口)，上方盖子有一烟囱状气体出口。

从烟熏处理开始的第17天晚上21 ∶30开始对小鼠进行灌胃直至烟熏结束，灌胃共计16 d(中间1 d不进行灌胃)。灌胃剂量参考隋世燕等(隋世燕等, 2017)和甘平等(甘平等, 2011)文献，熏烟组使用生理盐水灌胃(10 mL/kg体重)；低剂量组灌胃美洲大螊醇提物(10 mL/kg体重，0.09 g/mL)；高剂量组灌胃美洲大螊醇提物(10 mL/kg体重，0.27 g/mL)。实验结束后，采集全血和肺脏。所有实验小鼠均自由采食、饮水，保持室温。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1主要试剂

SOD、GSH-Px、CAT、MDA和NO检测试剂盒，均购自南京建成；Trizol购自Life Technologies；含SYBR GREEN的DNA聚合酶、DNA酶，购自Takara；反转录酶购自Promega；RNA酶抑制剂和dNTP，购自南京生兴。引物由苏州金唯智合成。

1.2.2主要仪器

可见分光光度计；NanoDrop分光光度计(ND-1000)；普通PCR仪；实时荧光定量PCR仪；荧光显微镜(BX41)。

1.3 试验方法

1.3.1样本采集

实验开始36 d后采样，称量体重后摘眼球法取血，注入含肝素钠的2 mL EP管；采集肺脏称重，每个肺脏剪取相同部位的部分肺组织放入4%多聚甲醛进行固定，剩余肺脏放入EP管中，置-80℃冰箱保存。血液4 000转/min离心10 min，收集上清。肺脏病理切片由大理州人民医院病理科制作。肺脏系数即肺脏体重比，是肺脏与体重质量的比值。

1.3.2血浆中各氧化和抗氧化应激指标测定

相关指标的测定按照商品说明书进行操作。

1.3.3基因表达测定

1.3.3.1 RNA提取及质量控制

使用Trizol提取肺脏组织总RNA，然后使用NanoDrop测定其浓度，如果超过2 000 ng/μL则稀释后重测，使OD260/280在2.0左右。最后取6 μg RNA，使用双蒸水稀释到500 ng/μL，每管吸取4 μL，各吸2管，用于RNA反转录。

1.3.3.2 反转录

使用两步法进行反转录，反应总体积为25 μL。反转录产物置4℃冰箱备用。

1.3.3.3 引物设计

根据GenBank上小鼠的相关cDNA序列，使用CNKI网站中的Primer-BLAST设计目的和内参β-Actin基因的引物，最后由苏州金唯智合成(表1)。

表1 基因表达引物序列

1.3.3.4 PCR扩增反应

将cDNA原液稀释10倍，使用实时荧光定量PCR仪进行检测目的基因的表达，使用20 μL体系。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，64℃退火20 s，72℃延伸20 s，共35个循环。统计方法使用2-ΔΔCt法。

1.4 数据统计与分析

所有实验数据均采用平均值±标准误表示，使用SPSS 17.0中的One-Way ANOVA进行统计分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏系数和血液中各指标的影响

2.1.1对血浆中SOD和CAT活力及肺脏系数的影响

4个组对小鼠血浆中总SOD和CAT活力以及小鼠肺脏系数的影响相互之间均没有统计学意义(P>0.05)。

2.1.2对血浆中NO、MDA含量和GSH-PX活力的影响

低剂量和高剂量美洲大蠊组与对照组相比，对血浆中NO和MDA的含量(图1-A和图1-B)以及GSH-PX的活力(图1-C)的影响均无统计学意义(P>0.05)。但是，与对照组相比，熏烟组显著升高了血浆中NO的含量(P=0.027)，显著降低了血浆中GSH-PX的活力(P=0.028)；与熏烟组相比，低剂量组(P=0.041和P=0.025)和高剂量组(P=0.029和P=0.028)均显著降低

图1 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠血浆中NO、MDA和GSH-PX水平的影响Fig.1 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on the level of NO、MDA and GSH-PX in plasma of mice by cigarette smoke注：“*”表示P<0.05，两组之间比较差异显著。Notes: “*” meant P<0.05, differed significantly between two groups.

了血浆中NO和MDA的含量；而高剂量组则显著升高了血浆中GSH-PX的活力(P=0.029)，分析结果见图1。

2.2 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏中各指标的影响

2.2.1对肺脏中SOD及CAT活力的影响

4个组对小鼠肺脏中总SOD和CAT活力的影响相互之间均没有统计学意义(P>0.05)。

2.2.2对肺脏中NO、MDA含量和GSH-PX活力的影响

低剂量和高剂量美洲大蠊组与对照组相比，对肺脏中NO和MDA的含量(图2-A和图2-B)以及GSH-PX的活力(图2-C)的影响均没有统计学意义(P>0.05)。但是，与对照组相比，熏烟组显著升高了肺脏中NO(P=0.036)和MDA(P=0.026)的含量。与熏烟组相比，低剂量组(P=0.040和P=0.046)和高剂量组(P=0.037和P=0.013)均显著降低了肺脏中NO和MDA的含量；并且低剂量组(P=0.040)和高剂量组(P=0.036)均显著升高了肺脏中GSH-PX的活力，分析结果见图2。

图2 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏中NO、MDA和GSH-PX水平的影响Fig.2 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on the level of NO、MDA and GSH-PX in lung of mice by cigarette smoke注：“*”表示P<0.05，两组之间比较差异显著。Notes: “*” meant P<0.05, differed significantly between two groups.

2.3 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏组织结构的影响

对照组小鼠肺泡大小、分布基本均匀、结构完整(图3-A)，气道壁结构清晰、上皮完整，纤毛尚存(图4-A)。熏烟组肺泡分布较为凌乱，肺泡隔变厚、有断裂，肺泡腔融合变大，有渗血现象(图3-B)。与熏烟组相比，低剂量组肺泡分布有改善，肺泡隔断裂较少，但较正常对照组肺泡腔融合扩大现象较严重，肺泡隔增厚(图3-C)；而高剂量组小鼠肺泡组织、结构明显改善，渗血减少，接近正常对照组，但仍有肺泡腔融合现象(图3-D)。

图3 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏病理的影响(10×)Fig.3 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on lung pathology of mice by cigarette smoke (10×)注：A，对照组；B，熏烟组；C，低剂量组；D，高剂量组。Notes: A, Control group; B, Smoking group; C, Low-dose group; D, High-dose group.

熏烟组小鼠肺小气道上皮细胞排列不整齐，受损明显，纤毛脱落、丢失(图4-B)，而低剂量组(图4-C)和高剂量组(图4-D)均有改善。可见，低剂量和高剂量的美洲大蠊醇提物对香烟造成的肺组织损害有缓解作用，高剂量组效果更好。

图4 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏病理的影响(40×)Fig.4 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on lung pathology of mice by cigarette smoke (40×)注：图中箭头所指即小气道上皮。A，对照组；B，熏烟组；C，低剂量组；D，高剂量组。Notes: The arrow in the picture refered to the small airway epithelium. A, Control group; B, Smoking group; C, Low-dose group; D, High-dose group.

2.4 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏中抗氧化应激相关基因表达的影响

2.4.1对SOD和CAT基因表达的影响

4个组对小鼠肺脏中SOD和CAT基因表达的影响相互之间均没有统计学意义(P>0.05)。

2.4.2对GSH-PX基因表达的影响

低剂量和高剂量美洲大蠊组与对照组相比，对肺脏中GSH-PX基因的表达的影响均没有统计学意义(P>0.05)。但是，与对照组相比，熏烟组极显著降低了小鼠肺脏中GSH-PX基因的表达(P<0.01)；与熏烟组相比，低剂量和高剂量的美洲大蠊乙醇提取物均显著上调了小鼠肺脏GSH-PX基因的表达水平(P<0.05)，分析结果见图5。

图5 美洲大蠊醇提物对熏烟小鼠肺脏GSH-PX基因表达的影响Fig.5 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on the level of GSH-PX mRNA expression in lung of mice by cigarette smoke注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，两组之间比较差异显著。Notes: “*” meant P<0.05, “**” meant P<0.01, differed significantly between two groups.

3 结论与讨论

美洲大蠊中具有显著的抗肿瘤、促进血管增生和组织修复、抗菌、抗肝炎等活性物质，目前，很多科学家和科研单位正致力于美洲大蠊抗肿瘤、结肠癌、肝纤维化等有效活性成分的研究上，针对其抗氧化应激的作用效果主要停留在体外研究上，而本文是在体研究美洲大蠊乙醇提取物抗氧化应激的效果，并且结合社会难题研究该提取物对香烟引起的肺脏氧化应激的干预效果，从选题上具有创新性，也具有一定的应用价值。

机体内过多的氧自由基可以引起生物膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生MDA，引起细胞毒性(Oyawoyeetal., 2003)；GSH-PX是机体内重要的分解过氧化物的抗氧化酶，能够与SOD和CAT一起将体内氧化应激产生的H2O2和O2-转变为无害的H2O分子(Husainetal., 2001)。本实验发现，不同剂量的美洲大蠊醇提物能够显著降低熏烟小鼠血中氧化应激指标NO及MDA的含量，并且能够增加熏烟小鼠血和肺脏中GSH-PX的活力以及它在肺脏中的基因表达水平。这与邹俊波等(邹俊波等, 2016)研究美洲大蠊醇提物通过抗氧化作用预防小鼠急性胃溃疡的结果相类似。

烟雾刺激可以诱导活化嗜酸性粒细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞，又可以释放大量的氧化产物和氧自由基，进一步促进肺组织的破坏(Oyawoyeetal., 2003)。王冬雪等(王冬雪等, 2019)研究发现，经HE染色，吸烟组小鼠肺泡大小不一，结构不清晰，肺泡壁增厚，有断裂，肺泡腔融合变大；随烟量的增加，肺组织病理变化愈严重。而本研究发现，美洲大蠊醇提物能够有效缓解香烟对肺组织造成的上述损害。可见，美洲大蠊乙醇提取物对熏烟小鼠的机体具有显著的抗氧化应激功能，但是，其作用机理有待进一步研究。

美洲大蠊提取物如何通过消化系统进而影响肺脏机能未见报道。有研究发现，美洲大蠊提取物能够通过PI3K/AKT信号通路增加肺腺癌A549细胞的凋亡；也可以通过阻断MAPK信号通路中JNK、p38、ERK1/2蛋白的表达抑制肝脏星状细胞HSC-T6的增殖，有效保护肝硬化(范怀艳, 2015)，还可以通过阻断PI3K/AKT信号通路的传导来抵抗肝纤维化(张成桂等, 2010)。但是，美洲大蠊乙醇提取物对熏烟小鼠的肺脏抗氧化应激功能是否通过MAPK或PI3K/AKT信号通路发挥作用还不清楚。我们将在本研究的基础上，就美洲大蠊乙醇提取物的具体活性成分及其分子作用机制进行深入探讨。