基于紫外可见分光光度法检测烟碱公式的探讨

乔 鹏， 任昭辉， 崔日男, 林雨晟，于大鹏, 张守荣, 李 旭, 刘鹏飞*

(1.吉林烟草工业有限责任公司延吉卷烟厂；2.吉林烟草工业有限责任公司：吉林 延吉 133001；3.河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，河南 郑州 450002)

烟碱作为烟叶的特征成分不仅具有调节吸食者情绪的作用，而且是广谱杀菌剂和杀虫剂。随着检测技术的进步，烟碱的检测方法已从最初的硅钨酸重量法[1]，发展到后来的紫外分光光度法[2-5]、连续流动分析法[6]、气相色谱法(GC、GC-MS)[7-9]、液相色谱法(HPLC)[10-12]等。每种方法都有其适合的应用场景、需求和价值,也各具优缺点，如连续流动分析法、GC-MS、HPLC法检测精确度高，但是仪器较为昂贵；硅钨酸重量法设备简单但操作繁琐、步骤多且精确度较低。而紫外分光光度法操作较为简单，设备便宜，精确度较高，广泛应用于教学和实践中。

1977年原轻工业部烟草所推荐了用紫外分光光度法测烟碱。1982年王秀芝等[2]在此基础上补充了待测液的最适浓度、萃取时间等，并且修订了检测烟碱的计算公式；同年，孙瑞申等[3]又进行了细化和完善。前辈们得出的最重要的结论是验证和完善了烟碱含量计算公式，即

细读前辈们的研究结果，发现使用该公式的前提和相关注意事项有：1) 原公式是以硅钨酸重量法检测结果为标准制定，1.059是与该方法对比后的校正系数；2) 处理方法为蒸馏法，即把样品、水、氯化钠、氢氧化钠一起放入烧瓶中加热蒸馏，馏分经硫酸吸收后进行检测；3) 溶液吸光度在0.167～0.651，其对应烟碱浓度为5～18 mg/L；4) 原公式的提出是基于假设杂质对烟碱在259 nm处吸光度的干扰等于236 nm和282 nm处干扰形成梯形的中位线[4]。

在教学和实践应用中，该公式应用较广，但也存在一些瑕疵：1) 原公式的样品处理方法为蒸馏法，而该方法操作繁琐，因此在一些实际应用时很容易被忽视而采用溶剂萃取法[13-16]，不同的处理方法其杂质差异较大，原公式在此适用性存疑；2) 校正系数1.059以硅钨酸重量法为基准，现今可采用更精确的高效液相色谱法；3) 原公式以烤烟为原料，对其它类型烟叶的适用性未知。因此，该研究以高效液相色谱法检测结果为基准，采用更常用的溶剂萃取法进行前处理，分别以4种不同类型烟叶即烤烟、白肋烟、雪茄烟、晒烟为对象尝试对该公式进行完善，以便为应用者提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

烤烟(54个，产地云南、河南、江西、贵州、重庆)、晒红烟(4个，产地吉林)、白肋烟(4个，产地湖北)和雪茄烟(15个，产地海南、四川)，共计77个。

烟碱(加拿大，TRC)；醋酸钠、磷酸、三乙胺、盐酸、氢氧化钠、乙醇(分析纯，天津大茂)；乙腈、甲醇(色谱纯，天津科密欧)。

电子天平(上海上平，精度0.000 1 g)，超声仪(郑州生元，SYU-10-300 DT)，pH计(上海丰控，FK-PH10)，液相色谱(日本岛津，LC-20 A)，紫外可见分光光度计(上海元析，UV-5200)。

1.2 样品紫外扫描

用紫外分光光度计对烟碱(乙腈溶解)、乙醇、甲醇、烟样(5%甲醇萃取)在210 ～360 nm进行扫描。

配制不同浓度烟碱溶液，在259 nm处考察吸光度线性范围。

1.3 萃取溶剂对烟碱的影响

称取100 mg粉碎后过40目筛的烟叶样品(以下简称样品)，放入锥形瓶中，分别加入不同浓度的盐酸、氢氧化钠、氨水、甲醇的水溶液20 mL，震荡萃取30 min，用磷酸或三乙胺溶液调节pH值至5左右(甲醇萃取液无须调节pH值)，过滤至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC检测。

1.4 萃取时间对烟碱的影响

称取100 mg样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分别萃取10、15、20、25和30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC检测。

1.5 紫外分光光度法检测

称取100 mg样品，加20 mL 5%甲醇萃取30 min，过滤至50 mL容量瓶定容后得到样品溶液。样品溶液分成2份，1份用于液相色谱检测，1份稀释20倍后以水为对照用分光光度计进行检测，检测波长分别为236、240、260、282 nm。

1.6 液相色谱法检测

配制不同浓度烟碱标品溶液，用于绘制标准曲线。

色谱条件：岛津Shim pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A(90%甲醇+10%水，0.1%醋酸钠，pH值6.8)，流动相B(90%水+10%甲醇，10 ppm磷酸，pH值3.8)，流动相B占4.5%，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL。

1.7 数据处理

用外标法进行定性和定量检测，数据用Excel 2016和SPSS 19.0进行分析，用origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 样品的紫外扫描

由图1可知，烟碱最强吸收峰在259 nm处，谷底在236 nm处，大于282 nm后无吸收。而乙醇在小于268 nm时具有紫外吸收，因此，不能用含乙醇溶剂进行萃取后用紫外分光光度计检测烟碱含量。甲醇在大于240 nm时几乎无紫外吸收，因此，可以用作萃取溶剂。对5%甲醇水溶液作为萃取剂得到的4种类型烟叶的萃取液进行扫描后发现，各萃取液均在259 nm处有最强吸收。并且这4种样品溶液的谷底均在240～242 nm，大于烟碱的谷底所处波长236 nm。雪茄烟、白肋烟和晒红烟样品溶液的吸收曲线走势较为一致，在大于276 nm后雪茄烟、白肋烟和晒红烟溶液的吸光度均呈现缓慢下降走势，而烤烟溶液吸光度在276～328 nm内下降趋势不明显。

由表1可以看出，紫外吸收峰谷比值差异非常大，烟碱达到3.27，烤烟最小，为1.02，而3种晾晒烟比值较为接近，为1.22～1.27。

表1 烟碱、4种样品溶液的紫外吸收峰谷比值

由图2a、b可知，在烟碱浓度小于0.909 μg/mL(吸光度为0.047)和浓度大于128.424 μg/mL(吸光度2.088)，曲线有偏离趋势。在中浓度范围2.056(吸光度0.074)～116.080 μg/mL(吸光度1.935)其线性关系较好，R2为0.999 2，远远好于前人研究结果[2,4]中的线性范围0.167～0.671和0.2～0.8，线性范围的大幅扩展说明现今的紫外分光光度计性能有大幅提升。

2.2 萃取溶剂对烟碱的影响

烟碱是强极性的有机物，易溶于水和甲醇，该试验选取不同浓度的盐酸、氢氧化钠、氨水和甲醇考察不同溶剂的萃取效果(表2)。

由表2可知，不同浓度的甲醇溶液中烟碱含量总体高于氢氧化钠溶液，与氨水和盐酸萃取效果无显著性差异。根据许燕娟等[17]的研究结果，碱性溶液的强度对烟碱萃取率有较大影响，相同浓度下氨水溶液比氢氧化钠溶液检测到的生物碱种类多。类似地，Li等[18]用不同浓度氨水萃取烟叶中的生物碱，发现6%氨水好于其它浓度，也好于氢氧化钠溶液。综合考虑到甲醇溶液相比氨水和盐酸溶液有利于样品溶液的储存和液相色谱柱以及具有较好的抑菌性，因此，采用5%甲醇作为后续试验的萃取溶剂。

表2 4种不同萃取溶剂的烟样中烟碱萃取率

2.3 萃取时间对烟碱萃取率的影响

超声、微波等常用于辅助萃取试验，然而它们在提高萃取率的同时，也会带来更多杂质，这对于采用紫外分光光度法检测非常不利，因此，选择较为温和的常温震荡法进行萃取。由表3中可以看出，随着萃取时间的延长，萃取率升高，而在25、30 min时无显著差异，为保险起见采用30 min作为萃取时间。

表3 萃取时间对烟碱萃取率的影响

2.4 烟碱含量测定公式的探讨与拟合

原公式以236和282 nm为梯形的中位线法推测杂质在259 nm处的干扰。由图1可以看出，由于杂质的干扰，萃取液的紫外吸收谷底由烟碱的236 nm红移至240～242 nm处，而与之等距离的是276～278 nm。但从图1中可以看出，在波长小于278 nm时，4种类型样品溶液的紫外吸光度与波长形成的斜率较大，为减小误差而检测279～282 nm处吸光度。因此，以240、259和282 nm的吸光度用于新公式的拟合。烟碱含量以HPLC法检测结果为基准。

从表4中吸光度与烟碱含量的相关性结果可以看出，烟碱含量与240 nm相关性接近显著水平，这是因为烟碱在240 nm有紫外吸收，但又有杂质干扰造成的；与259 nm处吸光度相关性达到显著水平，这正是采用该方法原理所在。烟碱与282 nm处的吸光度相关性较差，这是因为烟碱在该处无吸收(图1)，其吸光度是因为杂质的干扰。而样品溶液在240、259和282 nm处的吸光度之间呈极显著相关性，这恰好说明杂质对这3个波长处的吸光度影响一致，这正是原公式建立的基础。

表4 不同波长吸光度与烟碱含量的相关性

以20个烤烟样品在240、259和282 nm处的吸光度为自变量，以HPLC检测烟碱含量为因变量用SPSS软件拟合回归得到拟合方程为:

C=(0.080 7+0.426 9×A259+ 0.473 9×A240-0.631 2×A282)V/m

式中,C为烟碱含量/%，A259，A240和A282分别为样品溶液的吸光度，V为样品溶液体积/L，m为烟样质量/g。

再分别以2个公式对剩余57个烟叶样品烟碱含量进行计算，然后分别将计算结果除以HPLC检测结果，则比值越接近1说明检测越准确。由图3可以看出，全部样品的原公式计算结果与HPLC检测结果的比值基本呈正态分布，且在0.75～1.25的部分占49.12%；而烤烟样品的比值在0.75～1.25的占55.88%，集中度略有提升；对于晾晒烟样品，其比值也呈正态分布，但集中度较烤烟低，0.75～1.25的仅占39.13%。全部样品的拟合公式计算结果与HPLC检测结果的比值基本呈正态分布，0.75～1.25的占61.40%，高于原公式；烤烟样品的比值在0.75～1.25的占76.47%，集中度有大幅提升；对于晾晒烟样品其集中度较低，比值在0.75～1.25也是仅占39.13%，但是比值在0.5～0.75和1.25～1.60的分别由17.39%、21.74%提升至26.09%、30.43%。可以看出，2个公式的结果均是烤烟集中度高于晾晒烟，这是因为：1) 2种方法的建立基础为烤烟，2) 晾晒烟的杂质对吸光度的干扰有差别。

3 讨论与结论

4种类型烟叶样品的紫外扫描显示，3种晾晒烟的图形一致而与烤烟有差别，表现为峰谷比值前三者较为接近，以及吸收波长大于276 nm后的走势呈缓慢下降而烤烟的紫外吸收几乎不变，说明不同烟草类型的杂质对吸收的影响有所差异。通过对不同萃取溶剂的考察发现，甲醇、盐酸和氨水萃取效率较高，选择甲醇作为萃取溶剂，是因为较好的抑菌性，并且有利于样品溶液的保存以及对色谱柱友好。

原公式建立的基础是朗伯比尔定律即烟碱含量与吸光度成正比。但是在实际测定过程中，由于检测仪器等的误差，标准曲线或者拟合曲线一般呈线性关系而非正比关系[9,19]。另外，该试验紫外扫描图和文献[20]中均显示烟碱在236 nm处有一定的紫外吸收，而不是无吸收，所以不能将236 nm处的吸光度全部作为杂质。样品溶液在240、259和282 nm处的吸光度之间存在极显著相关性说明杂质对这3处的吸光度影响较为一致，这正是2个公式建立的基础。通过2个公式的计算结果与HPLC结果的比值分布可以发现，对于烤烟样品，新拟合公式的精确度较原公式有大幅提升；而对于晾晒烟样品则没有明显提升，这是因为2个公式的建立均是以烤烟为基础而建立的，然而晾晒烟的杂质与烤烟不一样，这在紫外扫描图中也有所反映。下一步将收集更多晾晒烟样品，以建立更适用于它们的计算公式。