曼陀罗雄配子体发育及花粉活力测定研究

权赫根， 于楷力， 洪 国， 金英花， 全雪丽

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

目前为止曼陀罗研究主要集中在化学成分、药理、医学和环境修复方面[4-11]，也有种子萌发[12]及组织培养[13]方面的研究报道，尚缺少曼陀罗生殖生物学方面的内容，且曼陀罗属的很多野生资源未能在园艺或园林中得到充分利用。该试验采用常规石蜡切片法、TTC法对药用植物曼陀罗花粉母细胞减数分裂及雄配子体形成过程及其花粉活力进行了研究，为曼陀罗属植物生殖发育及杂交育种积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018年4～12月在延边大学农学院教育实践基地进行。4月初将种子温水(约40 ℃)处理4～5 h后播种到温室里，等幼苗长到20 cm左右时，移栽到试验田。种植密度为50 cm×50 cm，定期观察、采样。

1.2 方法

1.2.1 曼陀罗开花习性调查

主要调查曼陀罗植物的现蕾期(大量的花蕾出现)、始花期(开花数在20%左右)、盛花期(开花数在80%左右)、成熟结果期(结果数约80%)、枯萎期(不再有新果出现)。

1.2.2 曼陀罗雄配子体发育研究

在曼陀罗盛花期，上午10:30分左右用剪子剪取不同大小的新鲜花朵，按花蕾长度大小进行分级。A：小于1.5 cm；B：1.5～2.0 cm；C：2.0～2.5 cm；D：2.5～3.0cm；E：3.0～4.0 cm；F：4.0～5.0 cm；G：5.0～6.0 cm；H：6.0～7.0 cm；I：7.0～8.0 cm；J：大于8.0 cm。对以上曼陀罗花朵进行固定(FAA固定液)，石蜡切片法进行切片、染色、树胶封片后在显微镜下观察解剖结构。最后分析花蕾大小与花粉不同发育时期之间的相关性。

1.2.3 曼陀罗花粉活力测定研究及花粉粒大小

选取4个不同发育阶段(A花瓣即将露出花萼，花蕾长度4.5 cm左右；B花瓣已露出花萼，花蕾长度6.0 cm左右；C花朵开放时期，花蕾长度8.5～9.5 cm左右；D花朵萎蔫时期，花蕾长度9.0 cm，图1～2所示)的花粉，采用TTC法染色，测定其花粉活力。染成红色的花粉为活力高，未染色的为无活力。花粉活力=被染花粉数/总花粉数×100%。每个发育阶段测定花粉活力，重复3次。通过Image J测量软件测量成熟花粉粒大小。

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1.2.4 曼陀罗果实特性调查

在曼陀罗处于果实成熟的后期，选有代表性的10棵，调查其株高、单株果实数、单果重量、果实心皮数、单果种子数、果实大小、种子千粒重等。

2 结果与分析

2.1 曼陀罗开花习性调查

曼陀罗播种(4月初)后30 d,个别花蕾已经出现，但花蕾期比较集中时期为播种后的60 d，即6～7月中旬，持续1个半月。始花期为7月中旬～8月初，持续半个月；盛花期为8月，持续一个月；成熟结果期为8月末～9月末，持续1个月；10月初开始进入枯萎期，持续1个半月。

2.2 曼陀罗花粉母细胞减数分裂过程观察

曼陀罗花粉母细胞减数分裂过程如图3所示。

由造孢细胞发育形成的花粉母细胞在花粉囊内呈半圆状排列(图3-1)，染色比较深，与其他细胞容易区分。初期花粉母细胞排列紧密，囊内空间狭小，随着花粉母细胞的继续发育，即进入减数分裂，花粉囊也随着发育，囊内空间也随之变大(图3-2～12)。进入减数分裂的花粉母细胞体积变大，核也变大(图3-3)，染色质变成染色体，染色体排在细胞中间(图3-4)，后期同源染色体分离(图3-5)，均等移动到细胞两边(染色体减半)，这时胞质没有分裂，不形成二分体，属于同时型。两边的染色体又进行分裂(进行的是有丝分裂，图3-6)，形成4个核(图3-7)，核膜、核仁重新形成，细胞版形成，胞质分裂，最终形成染色体减半的4个子细胞，即四分体时期(图3-8)。四分体排列方式主要以四面体型为主(图3-8)。

2.3 曼陀罗雄配子体形成观察

四分体被胼胝质酶溶解后，互相分离，形成小孢子，最初形态不规则，体积小(图3-9)，继续发育后，体积变大，核在细胞的中央，细胞壁形成，萌发孔慢慢体现(图3-10)。进一步发育后，核的位置发生变化，原本在细胞中央的核移到细胞的一边，细胞内形成大液泡，核进入分裂期，3个萌发孔明显(图3-11)。核进行分裂后形成2个核，进入双核期，进一步发育后，一个核变成凸透镜形状，为精核，另一个核圆形，为营养核，成熟的花粉粒为2-细胞型(图3-12)。成熟的花粉粒表面有很多小毛刺，3个萌发孔。

2.4 曼陀罗花药壁的发育

花粉母细胞时期花药壁已经分化形成，如表皮、药室内壁、中层和绒毡层，但此时不同层次之间细胞形态结构无明显差异(图3-1～2)。母细胞进入减数分裂时期，花药壁最内层绒毡层迅速增大(图3-3)。从减数分裂Ⅰ中期，到减数分裂Ⅱ末期，绒毡层细胞发育达到最大值(图3-4～7)，四分体开始慢慢解体(图3-8)。花粉粒完全成熟后，绒毡层也彻底解体消失，同时药室内壁细胞径向迅速伸长，壁上出现纤维加厚。曼陀罗花药壁上的药室内壁细胞为1～2层(图3-12)。花粉囊开裂时，花药壁仅留下表皮和纤维化的药室内壁，中层与绒毡层解体。

2.5 曼陀罗花粉发育时期与花蕾大小之间相关性

曼陀罗花蕾长度与花粉发育之间具有相关性。造孢时期，母细胞时期和减数分裂都在小于1.5 cm时进行；四分体时期和单核中央期在1.5～2.0 cm时进行；单核靠边和双核初期在2.0～2.5 cm时进行；双核初期和双核后期在2.5～4.0 cm时进行；花蕾长度在4.0 cm以上时，花粉都已成熟。小孢子单核靠边期主要在花蕾长度2.0 cm左右时进行(表1)。

表1 曼陀罗花粉发育与花蕾大小相关性

2.6 曼陀罗花粉活力测定及花粉粒大小

选取4个不同发育阶段的花蕾，测定其花粉活力(表2)。A发育阶段，花粉活力最低，为53.47%。B、C、D发育阶段之间花粉活力没有显著差异，分别为81.17%，87.11%和86.70%。对20个曼陀罗成熟的花粉粒进行大小测定，其大小(直径)为(31.58±0.82) μm。

表2 不同发育阶段曼陀罗花粉活力

2.7 曼陀罗果实特性调查

成熟的曼陀罗植株，平均株高92.2 cm。每棵曼陀罗产生的果实数量较多，平均结果数约100。平均单果重4.70 g。果实心皮数大部分为4个，均等(图4)，极个别有6个心皮(图5)。果实平均长度3.5 cm，平均宽度2.5 cm，果皮表面有很多针刺(图4～6)。每果种子数约500粒。种子为黑色，圆肾形(图7)，种子平均长度3.423 mm，种子平均宽度2.818 mm，种子千粒重7.2 g。

3 讨论与结论

曼陀罗花粉母细胞减数分裂及雄配子体形成过程与其他茄科植物[14-17]基本相似，属胞质同时型，四分体属四面体型，极个别为十字交叉型，成熟的花粉粒为2-细胞型。

植物的花粉发育分为小孢子发生时期、雄配体形成期和花粉成熟期3个阶段[18]。植物进行花药培养时，取材非常关键，取材过早小孢子还未形成，过晚小孢子已经形成多核花粉，失去脱分化的能力。所以确定小孢子发育时期相对应的花蕾长度大小指标很重要。该试验结果表明，曼陀罗花蕾大小与花粉发育各个时期之间存在相关性。花蕾长度大约在2.0 cm时，小孢子处于单核靠边期，这个时期是大多数植物进行花药培养的最佳时期[19-21]。所以，今后进行曼陀罗花药离体培养时，应取2.0 cm左右长度的花蕾为宜。

花粉活力一方面受遗传因素的影响，花粉活力还受环境因素的影响。影响花粉生活力的主要环境因素有温度、湿度和空气。因此，了解花粉在自然条件下的活力(遗传因素)、花粉贮藏的条件(环境因素)，在农、林业生产实践和遗传育种工作中具有重要意义[22-23]。该试验主要研究了曼陀罗植物在自然条件下不同开花阶段花粉的生活力，对曼陀罗植物来说，花粉活力已经在开花之前具备，之后的即将开放发育阶段，花朵开放发育阶段到花朵萎蔫期一直都具有较高的活力，这种长时间保持花粉活力的优势为曼陀罗杂交育种提供技术保证。至于曼陀罗花粉需要什么样的贮藏条件，有待于进一步研究。

植物生殖成功的前提除了与花粉活力有关外，还受到柱头可授性的影响。如柱头的可授期及最佳授粉时期在植物生殖过程中十分重要，在很大程度上影响着传粉率及受精率。有关曼陀罗植物柱头可授性强弱及最佳授粉时期，还需要进一步试验研究。