Hsa_circ_0001727在肝细胞癌组织中的表达及与预后的关系

张 燕，齐红杰

(郑州大学第一附属医院门诊，河南 郑州 450000)

肝细胞癌是世界第四大恶性肿瘤，同时也是全球第三大癌症死亡原因[1]。肝细胞癌起病隐匿，早期无特异性临床特征，多数患者在确诊时已进展为中晚期，因此，肝细胞癌患者死亡率居高不下[2-3]。近年来，随着医学技术的发展，针对肝细胞癌的治疗方式越来越多，如经肝动脉化疗栓塞、靶向治疗及射频消融术等，在改善患者生存质量、延长生存时间方面取得较好的疗效，但仍有部分患者术后复发、转移或死亡，预后较差[4-6]。而目前临床尚无可用于评估肝细胞癌患者预后的指标，虽有部分肿瘤生物标志物被用来预测肝细胞癌患者的预后，如癌胚抗原，但其灵敏度较低，预测能力十分有限[7]。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类新型非编码RNA，已有多种cricRNA被证实[8-10]参与肝细胞癌的病理生理进程。然而关于hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后的关系并未完全阐明。因此，笔者开展本研究，以期为临床预测肝细胞癌患者预后提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料前瞻性选取2015年8月至2016年8月间在郑州大学第一附属医院接受治疗的118例肝细胞癌患者作为研究对象。根据《原发性肝癌规范化诊治专家共识》[11]中关于肝细胞癌的诊断标准，对疑似肝细胞癌患者进行诊断。纳入标准：(1)初次就诊并经病理活检确诊为肝细胞癌；(2)入组前未接受放化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗；(3)术后接受规律随访；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)伴有其他部位恶性肿瘤；(2)合并重要器官功能不全；(3)发生远处转移者。118例肝细胞癌患者中，男性76例，女性42例，年龄47～74岁，平均年龄(63.82±5.74)岁，巴塞罗那(barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期A期78例，B期40例。本研究获得郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法采用qRT-PCR法检测肝细胞癌患者hsa_circ_0001727的相对表达量。在无菌环境下将肝细胞癌组织及癌旁组织用剪刀剪碎，用液氮研磨。取研磨液于试管中，4 ℃下4000 r/min离心15 min，取离心后上清液置于EP管中，待测。用TRIzol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶及紫外分光光度计测量RNA的浓度及纯度，取总RNA 2 μL加入反转录试剂盒中，进行反转录反应，合成cDNA，最后PCR扩增。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40个循环，72 ℃ 30 s，40个循环。hsa_circ_0001727基因序列正向：5′-GAGGCCCAGCTCAGTGTG-3′，反向：5′-GGCTGCAATGGTCTTGTTGG-3′；以GAPDH为内参，GAPDH正向：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，反向：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt表示hsa_circ_0001727相对表达量。

1.3 随访采用门诊及电话等方式对患者进行为期三年的随访，了解患者生存情况，每月随访1次。起始时间为2015年9月5日，截止时间为2019年9月17日，中位随访时间为29个月。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理。服从正态分布的计量资料用“均数±标准差”表示，肝细胞癌组织及癌旁组织hsa_circ_0001727相对表达量比较采用配对样本t检验，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料用例或率[n(%)]表示，采用卡方检验。用受试者工作特征曲线(ROC)分析hsa_circ_0001727评估肝细胞癌患者预后的价值。采用Kaplan-Meier及Cox单因素及多因素回归分析影响肝细胞癌患者预后的相关因素。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌组织与癌旁组织中hsa_circ_0001727相对表达量比较肝细胞癌组织hsa_circ_0001727相对表达量为(0.87±0.32)低于癌旁组织(1.39±0.42)，差异具有统计学意义(t=10.584，P<0.001)。

2.2 hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者临床病理特征的关系hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者性别、年龄、体质量指数、肿瘤直径、HbsAg及病灶位置无关(P>0.05)；而与BCLC分期、病灶数目、分化程度有关(P<0.05)，见表1。

表1 hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者临床病理特征的关系

2.3 hsa_circ_0001727评估肝细胞癌患者预后的效能118例肝细胞癌患者1～3年生存率分别为84.75%(100/118)、75.42%(89/118)和68.64%(81/118)。死亡组患者hsa_circ_0001727相对表达量为(1.16±0.28)低于生存组(1.51±0.41)，差异具有统计学意义(P<0.001)。hsa_circ_0001727评估肝细胞癌患者预后的AUC、敏感度、特异性、最佳截断点分别为0.811[95%CI(0.72，0.877)]、94.59%、64.20%、1.45，见图1。

图1 hsa_circ_0001727评估肝细胞癌患者预后的ROC曲线

2.4 影响肝细胞癌患者预后的因素将性别(女=0，男=1)、年龄(<65岁=0，≥65岁=1)、体质量指数(<24 kg/m2=0，≥24 kg/m2=1)、肿瘤直径(<5 cm=0，≥5 cm=1)、HbsAg(阳性=0，阴性=1)、BCLC分期(A期=0，B期=1)、病灶数目(单发=0，多发=1)、病灶位置(单侧=0，双侧=1)、分化程度(高、中分化=0，低分化=1)、肝动脉化疗栓塞(是=0，否=1)、hsa_circ_0001727作为自变量，将肝细胞癌患者预后情况(生存=0，死亡=1)作为因变量纳入Cox单因素回归分析，结果显示分化程度、肝动脉化疗栓塞及hsa_circ_0001727可能与肝细胞癌患者预后存在关联。按纳入标准α≤0.10，将上述因素纳入Cox多因素分析，结果显示肝动脉化疗栓塞及hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后密切相关，见表2。

表2 影响肝细胞癌患者预后的Cox回归分析

3 讨论

肝细胞癌具有恶性程度高，死亡率高的特点[12-13]。早期发现和早期治疗是改善肝细胞癌患者预后的关键。此前，有研究利用肿瘤标记物预测肝细胞癌患者预后，如甲胎蛋白，但其敏感度较低[14]。因此，寻找新的生物标志物来替代或联合甲胎蛋白等指标用于临床预测患者预后显得尤为迫切。目前，关于hsa_circ_0001727在肿瘤中的作用已有初步探索，然而目前未见关于hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后的报道。因此本研究就hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后的关系进行探讨。

本实验比较了肝细胞癌组织及癌旁组织中hsa_circ_0001727的相对表达量，结果显示肝细胞癌组织中hsa_circ_0001727相对表达量低于癌旁组织，表明hsa_circ_0001727可能参与肝细胞癌的发生过程。通过分析hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者临床病理资料的关系发现，hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者BCLC分期、病灶数目、分化程度有关，提示hsa_circ_0001727可能与肝细胞癌病程发展存在关系。通过对患者进行为期三年的随访，了解到肝细胞癌患者1～3年的生存率分别为84.75%、75.42%、68.64%，与刘爱祥等[15-16]研究结果相似。通过比较不同预后患者hsa_circ_0001727的相对表达量，发现死亡组患者hsa_circ_0001727相对表达量低于生存组患者，提示检测hsa_circ_0001727相对表达量可能有助于预测肝细胞癌患者的预后情况。因此，笔者构建了hsa_circ_0001727预测肝细胞癌患者预后的ROC曲线，结果显示hsa_circ_0001727预测肝细胞癌患者预后的AUC为0.827，表明hsa_circ_0001727预测肝细胞癌患者预后的效能较高。为明确hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后的关系，笔者采用Cox回归分析影响肝细胞癌患者预后的因素，发现肝动脉化疗栓塞、hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后密切相关，结果与既往研究[17]相符。

细胞实验证实，hsa_circ_0001727可调节生存素的表达水平[18]。生存素是凋亡抑制因子家族成员，其可参与调控细胞的死亡过程，抑制肿瘤细胞的凋亡，使细胞的程序性死亡过程减弱，造成细胞凋亡减少、增殖活性增强，进而导致肿瘤体积增大[19]。此外，生存素还具有抑制半胱氨酸蛋白酶-3的作用，半胱氨酸蛋白酶-3是促凋亡因子激活的重要蛋白酶，其在细胞早期凋亡中起到关键作用。活化的半胱氨酸蛋白酶-3可特异性降解细胞蛋白和核糖聚合酶，进而促进肿瘤细胞DNA损伤并抑制肿瘤细胞生长[20]。因此笔者推测hsa_circ_0001727可能通过调节生存素的表达参与肝细胞癌的疾病进展。

综上所述，hsa_circ_0001727与肝细胞癌患者预后密切相关，检测hsa_circ_0001727表达情况有助于预测肝细胞癌患者预后。本研究仍存在一定不足，下一步将继续开展基础研究，分析hsa_circ_0001727影响肝细胞癌患者预后的病理生理机制。