甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡血清免疫和盲肠菌群的影响

■卓春柳 王方方 石玉祥

（河北工程大学，河北邯郸056107）

自20世纪60年代以来，全球畜牧业生产大幅增长，这是世界人口增长和粮食需求增加的直接后果[1]。抗生素在畜牧业发挥了重要作用，抗生素不仅可以预防、控制和治疗动物疾病，还可用作生长促进剂增加畜牧业产值。然而，其过度使用导致了动物微生物种群抗生素耐药性，抗生素滥用及大量耐药菌出现引起全球公共卫生关注[1-2]。许多国家开始禁止在动物饲料中使用抗生素：1986年瑞典禁止在动物饲料中添加抗生素；2006年欧盟禁止在猪生产中使用抗生素生长促进剂，预计未来几年将有467个国家加入禁抗行列[3]；2001年我国公布168号公告，提出可使用的饲料添加剂只有33种，2019年发布征求意见稿提出“除中药外药物添加剂退出市场”。动物饲料中禁止使用抗生素不仅导致动物产量下降，同时会增加消费者食源性感染风险。因此，开发具有成本效益的抗生素替代品是最大的挑战，对动物生产的长期可持续性和盈利能力至关重要。当前抗生素代替品需具有安全无污染、机体易吸收、不易产生耐药性的特点[4]。药食同源的天然植物俨然已成为未来畜牧业发展的方向[5]。研究报道杜仲具有极高药用价值，其提取物中富含绿原酸、黄酮、木脂素等药理成分，其中绿原酸具有广泛抗炎抑菌，可抑制细菌生长、减少促炎细胞因子分泌、抑制病毒感染等[6]。绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)不仅在杜仲中含量丰富[7]，还可从咖啡豆[8]、水果、蔬菜[9]、菊科[10]及忍冬科等多种植物中提取出来。研究报道甜叶菊提取物具有抗炎抑菌、抗癌抗氧化、降血糖血脂等极高药理特性，甜叶菊中总咖啡酰奎宁酸含量达3.28%，双咖啡酰奎宁酸含量占2.65%[11]，其水提物及絮凝上清液中除甜菊糖苷外还含有多种绿原酸类和黄酮类药理成分。CGA作为一种功能性膳食多酚类物质，不仅来源广泛、绿色健康、无污染和不易产生耐药性，且具有抗炎抑菌、免疫调节、抗氧化等多种生物功能[12-15]，在近几年基础和临床研究中都提到了摄入CGA后有降低各种疾病的风险，可替代抗生素和激素类药物成为理想饲料添加剂，在动物养殖中具有广泛应用前景，符合绿色添加剂开发趋势。当前关于甜叶菊中绿原酸提取物在动物上的研究极少，大多研究试验材料所用的绿原酸主要来源于杜仲[16]、金银花[17]和菊花[18]等，本试验所用绿原酸提取自甜叶菊（提取自甜菊糖苷后所剩残渣）；另外目前大部分研究报道为CGA对鱼[19]、断奶仔猪[4，20-22]和鼠[14，23]的影响，对蛋雏鸡相关研究未见报道。本研究则将甜叶菊绿原酸作为试验材料，研究甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡肠道菌群和血清免疫指标的影响。绿原酸主要通过提高机体自身免疫力，改善肠道微生物区系，影响肠道菌群平衡促进动物生长。因此本试验以蛋雏鸡为研究对象，采用ELISA、盲肠内容物进行细菌培养法，检测分析蛋雏鸡免疫力和盲肠菌群变化，初步筛选甜叶菊绿原酸合适作用剂量，为绿原酸作为蛋雏鸡新型抗生素替代品应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

甜叶菊绿原酸（绿原酸纯度60%，其余主要为糖苷类物质）和杜仲提取物（绿原酸纯度8%，其余主要为杜仲黄酮和杜仲多糖）均由晨光生物科技集团提供。

1.2 试验设计与饲养管理

选择1日龄健康海兰蛋鸡300只，随机分为5组，分组情况见表1，每组3个重复，每个重复20只鸡，公母各半。预试期7 d后开始试验，7、14日龄和21日龄时按表1分别向试验组蛋雏鸡的饮水中添加不同药物，每日1次，连用5 d。按饲养标准进行饲养管理，试验动物基础饲粮组成及营养水平见表2，试验周期25 d，饲养试验于2019年在河北省邯郸市河北工程大学生命学院试验动物房进行。

表1 试验分组

表2 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 ELISA检测血清免疫相关指标

血清样品的制备：分别在第5次饲喂绿原酸90 min后，每组取3只鸡，心脏取血，5 000 r/min离心5 min，取上清液并分装，获得血清样品，于-20℃冰箱冻存待测。严格按照ELISA试剂盒（南京建成生物有限公司）说明书检测血清IL-1β和IL-2水平。

1.4 细菌培养法检测甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡盲肠菌群的影响

盲肠内容物样品的采集：分别在第5次饲喂绿原酸90 min后，每组取3只鸡，取盲肠食糜内容物，用于平板菌落计数，具体操作如下：

将1 g盲肠内容物置于烧杯中，加入9 mL生理盐水搅拌均匀后，吸取100μL于含有900μL生理盐水的EP管中充分摇匀，进行10倍系列稀释。倒入培养基摇匀，于37℃培养箱中倒置培养24 h后进行菌落计数，用营养琼脂培养基进行盲肠菌落总数计数，MRS培养基进行乳酸菌计数，伊红美蓝培养基进行肠杆菌计数，BBL培养基进行双歧杆菌计数，LBS培养基进行乳杆菌计数。

1.5 数据分析

试验数据统计采用统计学软件SPSS 20.0进行处理分析，差异显著性检验采用方差分析，有不同字母标注表示差异显著（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡血清免疫指标的影响(见表3)

表3 饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡血清免疫指标变化（ng/L）

由表3可知，7日龄开始饲喂：与空白对照Ⅰ组相比，添加杜仲和甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡血清IL-1β均无显著影响（P＞0.05）；与阳性对照组Ⅱ组相比，Ⅳ可显著降低蛋雏鸡血清IL-1β、IL-2含量（P＜0.05），其余组均无显著影响（P＞0.05）。14日龄开始饲喂：与空白对照Ⅰ组相比，添加杜仲和甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡血清IL-1β、IL-2均无显著影响（P＞0.05）；与阳性对照组Ⅱ组相比，甜叶菊绿原酸组均无显著影响（P＞0.05）。21日龄开始饲喂：与空白对照Ⅰ组相比，添加杜仲和甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡血清IL-1β、IL-2有降低趋势，其中Ⅱ组和Ⅴ组蛋雏鸡血清IL-1β显著降低（P＜0.05），Ⅴ组蛋雏鸡血清IL-2显著降低（P＜0.05）；与阳性对照组Ⅱ组相比，甜叶菊绿原酸组对IL-1β无显著影响，Ⅴ组蛋雏鸡血清IL-2显著降低（P＜0.05）。

2.2 甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡盲肠菌群的影响

2.2.1 7日龄时饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡盲肠菌落计数结果(见表4)

表4 7日龄时饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡盲肠菌落计数结果[Lg(CFU/mL)]

由表4可知，与对照组和杜仲组相比，盲肠细菌总数均有下降，其中Ⅲ、Ⅴ组均显著下降（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ组可显著降低盲肠肠杆菌数量（P＜0.05）；盲肠乳酸菌数量有上升趋势，其中Ⅲ、Ⅴ组显著升高（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅴ组均可显著升高盲肠乳杆菌数量（P＜0.05）；Ⅳ、Ⅴ可显著升高盲肠双歧杆菌数量（P＜0.05）。

2.2.2 14日龄时饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡盲肠菌落计数结果(见表5)

由表5可知，与对照组和杜仲组相比，甜叶菊绿原酸（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组）盲肠细菌总数均有下降；Ⅴ组盲肠肠杆菌数量显著升高（P＜0.05）；甜叶菊绿原酸添加组盲肠乳酸菌、乳杆菌和双歧杆菌数量均显著升高（P＜0.05）。

表5 14日龄时饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡盲肠菌落计数结果[Lg(CFU/mL)]

2.2.3 21日龄时饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡盲肠菌落计数结果(见表6)

由表6可知，与对照组和杜仲组相比，Ⅳ、Ⅴ均可显著降低盲肠肠杆菌数量（P＜0.05）；甜叶菊绿原酸对盲肠乳酸菌、乳杆菌和双歧杆菌数量影响不显著（P＞0.05）。

表6 21日龄时饲喂甜叶菊绿原酸的蛋雏鸡盲肠菌落计数结果[Lg(CFU/mL)]

3 讨论

3.1 甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡血清免疫指标的影响

机体免疫机能的稳定对雏鸡正常生长具有重要影响，绿原酸可以通过抑制免疫细胞和免疫因子并活化免疫抑制因子等一系列抗炎反应，激活宿主细胞免疫及体液免疫进而增强动物机体免疫保护功能。当前关于绿原酸和杜仲提取物对蛋雏鸡血清免疫生化指标的影响研究未见报道。研究发现绿原酸可提高小鼠IL-2和TNF-γ等免疫因子的表达水平，升高断奶仔猪空肠黏膜中TNF-α转录水平的表达量[22]，降低断奶仔猪血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量，提高血清IgG含量[21]。另外杜仲提取物对动物机体免疫力同样具有促进作用。研究报道杜仲叶提取物可不同程度提高肉兔血清中IgA含量[24]，有效改善黄羽肉鸡免疫功能[25]，提高断奶仔猪血清总抗氧化能力及血清白蛋白和总蛋白含量(P＜0.05)[26]。本试验结果显示7日龄开始投服甜叶菊绿原酸和杜仲提取物对蛋雏鸡血清IL-1β、IL-2有提高趋势；14日龄开始投服，无显著影响；但21日龄开始投服，对蛋雏鸡血清IL-1β、IL-2有降低趋势，其中4 g/L甜叶菊绿原酸Ⅳ组可显著降低蛋雏鸡血清IL-1β和IL-2含量（P＜0.05）。IL-1β、IL-2等血清炎性细胞因子含量在一定范围升高有助于增强雏鸡免疫力，雏鸡处于炎症状态血清炎性细胞因子含量会有所升高，以用于抵抗炎性损伤。试验结果发现在蛋雏鸡7日龄和21日龄饲喂药物均具有显著影响，7日龄蛋雏鸡血清免疫细胞因子含量有升高趋势，而21日龄蛋雏鸡血清免疫细胞因子含量有降低趋势，另外试验过程中发现在21日龄饲喂绿原酸和杜仲时，蛋雏鸡均会有腹泻现象，而空白对照组均无，推测21日龄投服药物可能导致雏鸡发生炎性损伤，这可能与此时肠道菌群状态紊乱有关。因此后期试验可以选择于蛋雏鸡7日龄进行较合适。

3.2 甜叶菊绿原酸对蛋雏鸡盲肠菌群的影响

肠道作为消化吸收营养物质的重要场所，其肠道黏膜及结构的完整性、肠道微生物菌群的正常状态决定着肠道的正常吸收功能。研究报道绿原酸可以增加动物结肠微生物区系的多样性[27]，增加断奶仔猪结肠乳杆菌数量并降低大肠杆菌数量[28]。杜仲提取物同样也可促进动物肠道微生物稳定。研究发现杜仲提取物可增高小鼠厚壁杆菌门和变形菌门相对丰度，降低拟杆菌门相对丰度下降[29]，改善虹鳟肠道菌群结构[30]，显著降低肥育猪其腹泻率，调节肥育猪肠道菌群[31]。本试验研究结果显示7日龄开始投服，绿原酸不仅影响肠杆菌，还相应提高益生菌的数量，其中2 g/L甜叶菊绿原酸添加组Ⅳ组可显著降低盲肠肠杆菌数量（P＜0.05），提高盲肠益生菌数量（P＞0.05）；相对于杜仲提取物添加组，绿原酸调节益生菌的效果更好。而14日龄和21日龄开始投服，绿原酸调节肠道菌群的效果和杜仲提取物相近，这与前人研究结果一致。试验过程中发现在21日龄饲喂绿原酸和杜仲提取物，蛋雏鸡均会出现腹泻现象，推测此时出现的腹泻现象可能与肠道菌群失调有关。李永洙[32]对不同日龄（4、6、10、16、20和40日龄）蛋鸡盲肠内容物的细菌群落进行特异性引物图谱指纹和聚类分析，发现蛋鸡群各饲养阶段盲肠细菌群落差异显著，对鸡群正常生长发育影响较大。研究发现SPF鸡从孵化到84日龄正常肠道菌群发育存在明显差异，盲肠上存在大量兼性和严格厌氧菌，从第3 d可分离出显著水平链球菌和大肠菌群；前40 d以粪便链球菌和大肠菌群为主，后以乳酸菌为主；40 d后，菌群逐渐稳定，主要由粪便链球菌、大肠杆菌、拟杆菌和乳酸菌组成。鸡在不同日龄段（3～7日龄、14～28日龄）盲肠菌群结构存在显著差异，在21日龄左右盲肠优势菌正在发生变化，在饲喂绿原酸和杜仲后，可能会造成肠道菌群紊乱，从而出现群体腹泻现象。因此后期试验应选择蛋雏鸡7日龄饲喂2 g/L甜叶菊绿原酸。

4 结论

从本试验结果可以看出，在蛋雏鸡7日龄时开始添加2 g/L甜叶菊绿原酸后可明显调节蛋雏鸡肠道菌群平衡，增强蛋雏鸡免疫功能。