盐胁迫对菌根化沙枣幼苗生长性状的影响1)

徐娜

(中国邮政集团有限公司黑龙江省分公司，哈尔滨，150001)

宋福强 范晓旭 隋心 常伟

(黑龙江大学)

土壤盐渍化会改变土壤理化性质，影响植物种子萌发、生长、繁殖，从而导致植物生物量下降。全球作物每年因土壤盐渍化减产超过20%。盐碱地在我国分布广泛，有接近7%的农业耕地受到盐碱化影响，迫切需求对盐碱地的生态修复技术。

沙枣(ElaeagnusangustifoliaL.)为胡颓子科多年生落叶乔木或小乔木。因为其具有耐旱、耐盐碱、耐贫瘠、抗风沙等特点，已经被列为我国荒漠沙地和盐碱地造林绿化、土壤改良、生态改善的先锋树种。有关研究表明，沙枣可以在盐质量分数为1%的盐碱地正常生长，通过对其种子萌发、水分与渗透调节、抗氧化防御等进行测定，沙枣具有良好耐盐性[1]。

丛枝菌根真菌(AMF)可以和80%的陆生植物建立丛枝菌根(AM)共生体，在提高植物抗逆能力、营养吸收、转运和利用方面，丛枝菌根比单独的植物根系更具效率[2]。许多研究表明，丛枝菌根真菌能够通过促生长作用提高宿主植物耐盐性。Giri et al.[3]研究表明，在盐胁迫下，未接种丛枝菌根真菌聚生球囊霉(Glomusfasciculatum)的金合欢苗木，其根、茎的干质量显著下降，而接种丛枝菌根真菌有效促进了金合欢苗木生长；Porras-Soriano et al.[4]研究表明，接种摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根内球囊霉(Glomusintraradices)、近明球囊霉(Glomusclaroideum)3种丛枝菌根真菌，能够提高橄榄植株苗木在盐胁迫条件下的生长；Latef et al.[5]研究表明，在盐胁迫下，与非接种处理相比，接种丛枝菌根真菌的番茄具有更高根茎叶的干质量，更大叶面积和总生物量；另外，Khalil et al.[6]研究表明，在更高盐胁迫下，接种根内球囊霉的柑橘具有更高生物量；Borde et al.[7]研究表明，在适度盐胁迫下，接种聚生球囊霉可显著提高御谷(Pennisetumglaucum)的叶片数、茎长、根长。丛枝菌根真菌能够有效提高宿主植物在盐胁迫下的生物量，原因在于丛枝菌根真菌能够增强宿主植物氮、磷、钾等营养获取能力，改善了宿主植物在盐胁迫条件下的生长生理状态。与单纯使用耐盐植物不同，作为一种环境友好、经济高效可行的盐碱地治理新手段，丛枝菌根真菌技术在全球可持续农业和环境保护方面应用的巨大潜力已经受到国内外研究人员广泛关注。但是，目前关于丛枝菌根真菌是否能进一步提高耐盐植物的抗性，报道较少。本研究以实生沙枣苗木为供试植物、异形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)为供试菌株，采用盆栽培养方法，设置不同浓度的NaCl胁迫菌根化沙枣幼苗，测定不同浓度NaCl胁迫的菌根化沙枣幼苗的株高、基径、生物量、功能叶片生长参数、盐害症状，分析盐胁迫对菌根化植物生长的影响，旨在为利用耐盐植物联合菌根生物技术进行盐碱地生物治理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试沙枣(E.angustifoliaL.)品种锦绣1号，由黑龙江锦绣大地生物工程有限公司提供，该品系于2011年经黑龙江省林业厅鉴定，具有较强的耐盐碱和耐寒能力。

供试丛枝菌根真菌(AMF)菌种：选择能够提高宿主植物耐盐性的异形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)，获批专利ZL201510232876.3，菌剂中丛枝菌根真菌孢子量为25～30个/g。由黑龙江大学修复生态研究室筛选、扩繁及保存。

苗木培养基质的土壤，取自黑龙江省森林植物园(地理中心坐标：东经126°16′、北纬45°45′)。土壤过直径5 mm筛，按体积比与蛭石混合均匀(V(土壤)∶V(蛭石)=3∶1)，经3次高温高压灭菌(0.1 MPa，121 ℃，1 h)处理，等量分装至花盆(规格为33 cm×16 cm×15 cm)中。培养基质初始性质：pH=7.2，有机质质量分数1.2%，有效氮质量分数123.4 mg/kg，有效磷质量分数12.6 mg/kg，有效钾质量分数76.5 mg/kg，电导率0.5 dS/m。

1.2 试验方法

采用完全随机区组试验，包含2个因素：丛枝菌根菌剂接种处理，不接种的对照处理(NM)、异形根孢囊霉接种处理(M)；NaCl胁迫处理，0、100、200、300 mmol·L-1NaCl。每个处理6个生物学重复(见表1)。

表1 菌根化沙枣苗木盆栽盐处理试验设计

沙枣种子用质量分数的0.2%的KMnO4溶液表面消毒处理10 min，无菌蒸馏水润洗4次，播种于花盆中。丛枝菌根菌剂接种处理，接种量10 g/盆；对照处理，每盆接10 g灭活丛枝菌根真菌菌剂。定期检测丛枝菌根真菌侵染情况，当菌根侵染率达到90%以上时进行NaCl胁迫处理。为避免对苗木产生渗透休克，分2次进行盐胁迫处理，间隔期7 d，每次每盆施盐溶液1.5 L。完成盐胁迫后的30 d取样，用于各项指标测定。

菌根侵染率测定：参考采用醋酸墨水染色法将根段染色[8]，依据特鲁夫洛(Trouvelot)的方法[9]计算菌根侵染率，菌根侵染率=(有菌根根段数/总根段数)×100%。

株高、基径测量：每个处理中随机选取沙枣苗木20株，以米尺测量株高(精确至0.1 cm)，用游标卡尺测定基径(精确至0.01 mm)。

生物量积累与分配：每个处理中随机选取沙枣苗木20株，将单株沙枣苗木根、茎、叶分别收集，105 ℃杀青30 min，然后80 ℃烘干至恒质量，自然冷却；电子天平称量沙枣苗木根、茎、叶的干质量(精确至0.001 g)，计算全株总生物量、冠生物量、生物量分配比例。全株总生物量=根的干物质量+茎的干物质量+叶的干物质量；冠生物量=茎生物量+叶生物量；生物量分配比例=(各组织生物量/相应处理植株的平均总生物量)×100%。

叶片参数调查和测定：随机选取每个处理沙枣苗木20株，计数每株苗木的脱落叶片数量、枯黄叶片数量、完全展开功能叶片数量。其中，已经脱落或轻微触碰而脱落的叶片为脱落叶片，除全绿和仅叶尖枯黄以外的完全展开叶片为枯黄叶片，面积≥1 cm2的完全展开叶片为功能叶片。叶片脱落率=[脱落叶数/(脱落叶数+枯黄叶数+功能叶数)]×100%；叶片枯黄率=[枯黄叶数/(脱落叶数+枯黄叶数+功能叶数)]×100%；叶片盐害率=[(脱落叶数+枯黄叶数)/(脱落叶数+枯黄叶数+功能叶数)]×100%。

将每个处理的20株完全展开的叶片分单株收集于自封袋内。用扫描仪扫描叶片，根据叶面积计算软件(1.1版本)，计算各单株的总叶面积，记录叶片数量，并计算单叶面积、比叶面积、叶面积比率。单叶面积=总叶面积/总叶数；比叶面积=总叶面积/叶片的干物质量；叶面积比率=总叶面积/全株的干物质量。

数据处理与统计方法：采用Microsoft Excel 2003、GraphPad Prism 6.0软件进行数据处理。相同盐浓度胁迫处理的丛枝菌根真菌接种(M)和非接种(NM)处理之间的差异性，用独立样本t检验分析(P<0.05)。不同盐浓度胁迫处理之间的差异性，用单因素方差分析中的邓肯检验分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 丛枝菌根真菌对沙枣幼苗的侵染

异形根孢囊霉能够侵染并定殖于沙枣苗木根部。沙枣苗木接种异形根孢囊霉3个月后，菌根侵染率均达到90%以上，经显微镜镜检观察，可清晰观察到沙枣菌根根内菌丝、泡囊和丛枝结构(见图1)。

图1 沙枣菌根根内菌丝、泡囊和丛枝显微结构

2.2 盐胁迫对菌根化沙枣苗木株高和基径的影响

经过30 d盐胁迫，无论是否接种丛枝菌根真菌，盐胁迫均对沙枣苗木生物量产生明显抑制作用，显著降低沙枣苗木株高、基径(P<0.05，见表2)。盐浓度为100、200、300 mmol·L-1时：M处理、NM处理的沙枣苗木，株高总体均呈下降趋势，接种丛枝菌根真菌显著提高沙枣苗木的株高(P<0.05)，增加幅度分别为9.68%、13.53%、11.30%；M处理、NM处理的沙枣苗木，基径均呈显著下降趋势(P<0.05)，接种丛枝菌根真菌显著提高沙枣苗木的基径(P<0.05)，增加幅度分别为7.79%、6.67%、4.35%。

表2 经盐胁迫和接种丛枝菌根真菌的沙枣苗木株高和基径

2.3 盐胁迫对菌根化沙枣苗木生物量的影响

经过30 d盐胁迫，无论是否接种丛枝菌根真菌，盐胁迫均对沙枣生物量产生明显抑制，根、茎、叶的干质量和总生物量均在最高浓度盐胁迫时最低；但同一盐浓度处理时，M处理沙枣苗木生物量显著高于NM处理的(见表3)。

在无盐胁迫时，接种丛枝菌根真菌显著提高沙枣苗木根生物量、茎生物量、叶生物量、冠生物量、全株总生物量(P<0.05)，其中根的干质量增加19.05%、冠生物量增加24.44%、全株总生物量增加23.86%。

随着浓度升高的盐胁迫，M处理、NM处理沙枣苗木根的干质量均显著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫时，M处理沙枣苗木根的干质量与无盐胁迫处理的相比，分别降低16.00%、34.00%、 52.00%。相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木根的干质量均显著高于NM处理的，分别增加23.53%、26.92%、100.00%。

随着盐胁迫程度提高，M处理、NM处理沙枣苗木冠生物量均显著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫处理时，M处理沙枣苗木冠生物量比无盐胁迫沙枣苗木冠生物量，分别降低15.48%、37.50%、60.12%。相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木冠生物量均显著高于NM处理的。100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫处理时，M处理沙枣苗木冠生物量比NM处理的，分别增加39.22%、64.06%、109.38%。

随着盐浓度不断提高，M处理、NM处理沙枣苗木全株总生物量均显著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫处理，M处理沙枣苗木全株总生物量比无盐胁迫的，分别降低15.60%、37.16%、58.72%。相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木全株总生物量均显著高于NM处理的，100、200、300 mmol·L-1NaCl浓度处理时，分别增加了36.30%、52.22%、104.54%。

2.4 盐胁迫对菌根化沙枣苗木功能叶生长的影响

无盐胁迫时，接种丛枝菌根真菌显著提高了沙枣苗木单叶面积、比叶面积、叶面积比率(P<0.05)，分别增加了27.86%、14.91%、15.58%(见表4)。

M处理、NM处理沙枣苗木，均随着盐胁迫程度加剧显著降低了苗木单叶面积、比叶面积、叶面积比率(P<0.05，见表4)。其中，100、200、300 mmol·L-1盐胁迫处理时，M处理沙枣苗木单叶面积比无盐胁迫的，分别降低22.37%、41.44%、63.81%。相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木单叶面积均显著高于NM处理的(P<0.05)，100、200、300 mmol·L-1盐胁迫处理时，分别增加19.46%、40.65%和138.46%。

100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫处理，M处理沙枣苗木的比叶面积，比无盐胁迫的分别降低26.10%、42.50%、63.32%；相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木比叶面积均显著高于NM处理的(P<0.05)，分别增加3.37%、34.96%、30.90%。

100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫处理，M处理沙枣苗木叶面积比率，比无盐胁迫的分别降低28.51%、42.91%、58.01%；相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木叶面积比率均显著高于NM处理的(P<0.05)，分别增加6.94%、51.48%、130.27%。

经过30 d盐胁迫，对不同浓度盐胁迫处理的沙枣苗木叶片受害情况进行统计(见表5)，在无盐胁迫时，M处理、NM处理沙枣苗木下部老叶均出现一定程度脱落、枯黄。随着浓度升高的盐胁迫，M处理、NM处理的沙枣苗木植株，叶片脱落率、枯黄率、盐害率总体上均呈现显著升高趋势(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl胁迫处理，导致M处理沙枣苗木叶片脱落率、枯黄率、盐害率均显著升高，各浓度盐处理之间呈显著差异(P<0.05)。相同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木叶片脱落率、枯黄率、盐害率均显著低于NM处理的(P<0.05)。

表5 经盐胁迫和接种丛枝菌根真菌的沙枣苗木叶片脱落率和枯黄率

3 讨论

盐胁迫会显著抑制植物生长，因此，植物面临盐胁迫时，自身是否能够维持正常生长状态是衡量其耐盐能力的重要指标之一。丛枝菌根真菌能够帮助植物改善生长生理状态，缓解盐胁迫压力[10]。本研究表明，在同等盐胁迫条件下，接种异形根孢囊霉显著改善沙枣苗木生长状态，提高了株高、基径、根生物量、茎生物量、叶生物量、冠生物量、总生物量，通过维持较高生物量，有效稀释Na+等有害盐离子浓度，减弱了盐胁迫对植物毒害作用。盐胁迫时，菌根沙枣苗木表现出更高生物量，这与国内外已发表的诸多丛枝菌根真菌-植物共生体耐盐胁迫研究结果相一致[11-12]。

根系是植物吸收水分和营养成分的重要器官。植物根系是与盐碱、干旱、重金属等外源非生物胁迫因子最直接关联的器官组织，盐胁迫能抑制植物根系生长，降低植物根系表面积。丛枝菌根真菌通过与宿主植物根系结合，建立共生体系后，会促进根系发育，改变植物根系构型，增加根系生物量。因此，丛枝菌根真菌能够促进植物生长，与其促进根系发育、改善宿主植物根系形态特征有着密不可分的关系。目前诸多研究结果已经证实，为了更有利于宿主植物吸收水分、营养物质，菌根化植物往往具有更发达根系，以维持光合作用和生物量积累[3，5，13-14]。本研究中，盐胁迫显著降低了沙枣苗木根的生物量，接种异形根孢囊霉提高了沙枣苗木根系生物量，促进了根系生长，这有利于植物更好地适应盐胁迫。

植物受盐胁迫，导致叶面积减小，伴随茎生长减缓，光合速率降低，继而降低整体生物量。本研究中，盐胁迫时，M处理沙枣苗木冠生物量下降幅度小于NM处理的，表明接种异形根孢囊霉有效缓解了盐胁迫对茎叶生长的抑制作用，菌根化沙枣苗木对盐胁迫的耐受能力更强。

叶片是植物光合作用的重要器官组织，单叶面积指标与生物量积累能力密切相关，比叶面积、叶面积比率能够衡量植物在不同生境的环境资源获取能力。本研究中，在不同浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木单叶面积下降幅度小于NM处理的，并且在相同浓度盐胁迫时，菌根化沙枣苗木单叶面积显著高于非菌根化沙枣苗木的；且菌根化沙枣苗木比叶面积、叶面积比率，显著高于相同盐处理的非菌根化沙枣苗木的，这表明，盐胁迫的菌根化沙枣苗木具有更强光合作用能力，以提高生物量积累。植物叶片脱落、枯黄状态是盐胁迫的植物生长状态最直接体现，本研究中，高浓度盐胁迫时，M处理沙枣苗木叶片脱落率、枯黄率、盐害率显著低于NM处理的，说明接种异形根孢囊霉在一定程度上缓解了盐胁迫对沙枣苗木植株的生长抑制效应。

本研究表明，接种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉，不但对盐胁迫的沙枣幼苗的生长具有明显的促进作用，而且还可以增强其耐盐胁迫能力。这可为盐碱地资源开发利用和综合生态治理、把黑龙江省现有盐碱地变成绿洲、对沙枣这一林业潜在资源进行后期产业开发提供参考。